Summary
Immunohistokemiske metoder er nyttige i honningbiforskning til at detektere og vurdere niveauet af apoptose og nekrose i midgut og hypopharyngeal kirtler hos voksne bier.
Abstract
Honningbier (Apis mellifera L.) inde i bikuben (sygeplejerskearbejdere og andre bikuber) og uden for bikuben (foragere) udsættes for klima- og vejrændringer, forskellige pesticider, patogener og underernæring, der hovedsageligt kommer ind gennem munden og primært påvirker fordøjelseskanalen hos voksne bier. For at forstå og forhindre virkningerne af sådanne eksterne og interne stressfaktorer på honningbier er en nyttig forskningsmetode den immunohistokemiske metode. En grundlæggende protokol er beskrevet for at forberede midgut (ventriculus) og hypopharyngeal kirtler (HPG'er) hos voksne bier til histologisk analyse. En detaljeret metode er beskrevet for at vurdere niveauet af celleskader og skelne nekrose fra programmeret celledød (apoptose) som en naturlig proces med vævsregenerering. Resultaterne af behandling af voksne honningbier med oxalsyre og pesticider (insekticid og acaricid) og bestemmelse af celledød i ventriculus og HPG'er præsenteres. Fordele og ulemper ved metoden diskuteres også.
Introduction
Honningbier (Apis mellifera L.) er blandt andre vilde bestøvere de vigtigste bestøvere af landbrugsplanter. I løbet af tusinder af år har det skiftende miljø påvirket bier til at tilpasse deres morfologi, fysiologi, adfærd og tolerance til flere patogener og parasitter. Derfor har honningbier udviklet en meget forskelligartet vifte af arter og underarter rundt om i verden1. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere fund, at der er genetisk variation i honningbiens fordøjelseskanalstruktur, men tyder også på, at ændringer af midgut skyldes miljøfaktorer 2,3.
Honningbiens fordøjelseskanal har tre hoveddele: foregut, midgut (ventriculus) og hindgut4. Ventriculus er et vigtigt organ til fordøjelsen af pollen og nektar / honning; I bagkroppen foregår osmotisk kontrol gennem absorption af vand og ioner2. Hypopharyngeal kirtler (HPG'er) af honningbiarbejdere er placeret i hovedet og syntetiserer og udskiller kongelige gelékomponenter til at fodre bøden, dronningen og medlemmer af kolonien. Deres størrelse ændres med alder og opgaver og afhænger af korrekt ernæring (kvalitetspollen). Sygeplejersker i alderen 6 til 18 dage udfører yngelopdræt, og størrelsen på HPG'er stiger 5,6. I foragerbier degenererer HPG'erne og udskiller kun enzymer, der er vigtige for at omdanne de komplekse sukkerarter til enkle (α-glucosidaser, leucin arylamidase, invertase) i honning7.
Honningbier udsættes for flere biotiske og abiotiske stressfaktorer8, og fordøjelseskanalen kan påvirkes af flere negative stimulanser. Den første barriere, der beskytter organismen mod patogener, er den peritrofiske membran i midgut, som består af tarmslimhinden for at beskytte mod patogener4. Udviklingen og funktionen af HPG'er afhænger af kost, alder og kolonitilstand9 og påvirkes af insekticider, acaricider 10 og patogener11,12,13. Acaricide rester i bikuben på grund af varroa kontrol behandling og pesticider fra miljøet påvirker forager bier og sygeplejerske bier14,15. Den største trussel mod honningbikolonier er miden Varroa destructor, både som vektor af vira, der bidrager til kolonitab16 og som forbruger af værtens fedtlegeme (et vigtigt vitalt organ i honningbier), som følgelig påvirker individets krops- og kolonifunktioner17.
Imidlertid kan intensive landbrugsjordhabitater give en kortsigtet fødevareforsyning til honningbier. Derfor bør miljøvenlige landbrugsordninger øge tilgængeligheden af honningblomster i landbrugslandskaber18. For at vurdere morfologien af forskellige underarter 6,19,20,21 eller subletale virkninger af disse faktorer på celle- eller vævsniveau, især midgut og HPG'er, er histologiske og immunohistokemiske metoder praktiske og tilstrækkeligt nøjagtige til at blive anvendt i histologisk forskning i honningbier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grundlæggende histologi til honningbiforskning
- Dissektion af honningbivæv
BEMÆRK: Til dissektion af arbejderbier skal du bruge et dissekeringsmikroskop med en LED-lyskilde. Den mest nyttige forstørrelse er ~ 20x.- Manipulation og dissektion
- Tag forsigtigt en arbejderbi med tang og læg den på is (eller i fryseren ved -20 °C) i 2 minutter for at immobilisere den22. Fastgør bien på petriskålen diagonalt gennem den øverste bageste del af brystkassen to gange, fra venstre mod højre og fra højre mod venstre.
- Hæld insekt saltvand for at dække kroppen. Placer petriskålen under mikroskopet, fokuser og juster.
- Forbered instrumenterne (se materialetabellen).
- Dissektion af midgut
- Start med maven ved at indsætte et punkt på saksen under tergite A5 (figur 1) i midten af højre side af bikroppen. Klip til tergite A2.
- Hold saksens indre blad parallelt med siden af kroppen for at undgå at beskadige de indre organer. Drej saksen til venstre og lav et klip; drej til højre og lav endnu et snit. Åbn forsigtigt den venstre del af maven og fastgør den. Gentag på den anden side.
- Brug tang med den ene hånd til at trække honningbimaven forsigtigt opad og med en saks i den anden hånd skære i slutningen af spiserøret. Træk maven og midgut væk fra maven og skær ved endetarmen. Brug en pipette med insektsaltopløsning og fjern afføring eller dele af vævet.
- Dissektion af HPG'er
- Immobilisere en arbejderbi på is som beskrevet i trin 1.1.1. Skær hovedet af og læg det på den mindre plade med antennerne opad. Fastgør hovedet med to stifter: en gennem det venstre sammensatte øje og den anden gennem det højre sammensatte øje.
- Lav et snit over det første sammensatte øje på indersiden af stifterne, fortsæt til labrum, og lav derefter endnu et snit på den anden side over det andet sammensatte øje (figur 2).
- Skær antennerne af. Løft masken af og klip, hvor den stadig er fastgjort. Tag tangene og fjern forsigtigt kirtlerne sammen med hjernen og en del af de sammensatte øjne.
- Manipulation og dissektion
- Fiksering, dehydrering og indlejring af paraffin
BEMÆRK: Brug beskyttelseshandsker.- Anbring vævet i penicillinflasker, fyldt 3/4 med 10% formalin. Opbevares i køleskab ved 4 °C.
- Efter 24 timer dehydreres vævet i en række alkoholer: 70%, 80%, 90%, 100%, i 1 time hver, 100% 2-propanol i 1 time, 100% 2-propanol i 12 timer og endelig 100% 2-propanol i 1 time.
- Placer vævet i histokassetter; mærke og placere dem i glaskamrene med 2-propanol og paraffin (1:1) i en inkubator ved 60 °C i 24 timer.
- Flyt histokassetterne til et andet kammer med paraffin (I.) i yderligere 24 timer. Gentag proceduren med frisk paraffin to gange mere (II. og III.), begge i 24 timer.
- Til sidst skal du forberede monteringsstationen og begynde at indlejre vævet i voks.
- Åbn hver histocassette og fjern dækslet. Fyld formen med voks og læg forsigtigt vævet med varme tang i midten af formen.
- Placer histocassetten på formen og dæk den let med voks. Placer straks formen på den kolde overflade af monteringsstationen i et par sekunder, og læg den derefter på den kolde plade i et par minutter, indtil voksen hærder og adskiller sig fra formen sammen og histokassetten.
- Opbevar de færdige prøver i en kasse væk fra støv og varme.
- Skær 4 μm tynde sektioner på et mikrotom: først to sektioner fastgjort til hinanden og derefter en separat. Overfør sektionerne med tang, og lad dem flyde på destilleret vand (42 °C), saml dem derefter på rene rutsjebaner ved at placere to sektioner sammen på venstre side af målglasset og den tredje på højre side, der forbliver tydeligt adskilt. Efterlad de markerede dias natten over på varmeenheden, og opbevar dem til sidst i en kasse dedikeret til histologiprøver.
- Afvoksning og rehydrering
BEMÆRK: Brug beskyttelseshandsker.- Forbered ni Coplin-krukker og læg sektionerne i en række clearingmidler (I., II., III.) i 5 minutter hver.
- Sæt i 2-propanol, ethanol 96% (I., II.), alkohol 90% og 80% og destilleret vand i 3 minutter hver.
- Farvning med hæmatoxylin og eosin
BEMÆRK: Brug beskyttelseshandsker.- Forbered seks Coplin-krukker.
- Til hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning sættes de afvoksede, rehydrerede sektioner i hæmatoxylin i 5 minutter, og placeres dem derefter forsigtigt under det rindende ledningsvand i 2 minutter. Sæt dem derefter i destilleret vand i 1 minut og eosin i 4 minutter (for eosin er Coplin-krukken ikke nødvendig).
- Hældningerne i ethanol 96% i 1 min, derefter 2-propanol i 2 min, og til sidst i clearingmidlet i 2 min.
- Tilsæt monteringsmedium og et dækglas og lad dem tørre. Overhold under et lysmikroskop.
Figur 1: Dorsal visning af honningbikrop. A1-A7 tergites. De detaljerede instruktioner om dissektion af honningbier findes i Carreck et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dorsal visning af HPG'er, dele af sammensatte øjne knyttet til hjernen (ikke synlig). En ungarbejderbi i alderen 5 til 6 dage har fyldige og cremede hvide HPG'er. Acini er placeret på hjernen og fylder hovedområdet med grene, der når bagsiden af hjernen. I foderbier er disse kirtler stærkt krympet og efterlader kun tynde trådlignende rester. Af denne grund er det bedre at fjerne kirtler sammen med hjernen for at gøre det lettere i yderligere procedurer for at undgå at miste vævet. Skala bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Påvisning af celledød i vævssektioner
- Apoptosedetekteringssæt (Assay A)
BEMÆRK: Følg producentens protokol (se materialetabellen).- Forbered Coplin-krukkerne.
- Efter afvoksning og rehydrering (se trin 1.3) nedsænkes diasene i 0,85% NaCl-opløsning og derefter i fosfatbufferet saltvand (PBS) (5 min).
- Sæt diasene i 4% paraformaldehyd 2 x 15 min.
- Placer diasene fladt i beholderen og tilsæt 100 μL proteinase K (20 μg / ml) opløsning, og lad dem derefter stå i 10-30 min.
- Placer slides i PBS (5 min).
- Slides anbringes i 4% paraformaldehyd i PBS (5 min).
- Nedsænk diasene i PBS (2 x 5 min).
- Placer diasene fladt i beholderen, tilsæt 100 μL ligevægtsbuffer, og lad dem stå i 5-10 min.
- Tilsæt 100 μL TdT-reaktionsblanding. Læg papirhåndklæder inde i beholderen, rundt om diasene, fugt håndklæderne med vand og dæk derefter med plastfolie. Inkubere dias i 60 minutter ved 37 °C.
- Placer diasene tilbage i farvningsstativet og nedsænk i 2x saltvandsnatriumcitrat (SSC) i 15 min.
- Nedsænk diasene 3 x 5 min i PBS, derefter i 0,3% hydrogenperoxid i 3-5 min, og derefter i PBS igen, 3 x 5 min.
- Læg igen diasene fladt i beholderen, tilsæt 100 μL Streptavidin HRP (peberrodsperoxidase), og lad det stå i 30 minutter (dæk med plastfolie).
- Nedsænk diasene 3 x 5 min i PBS.
- Glideapparaterne anbringes fladt i beholderen, og der tilsættes 100 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB)-opløsning. Kig efter en lysebrun baggrund.
- Returner diasene til stativet og vask dem flere gange i vand (dobbeltdestilleret).
- Monter diasene under glasdæksler i monteringsmedium og lad det tørre fladt.
- Overhold under et lysmikroskop.
- Apoptose detektionssæt (Assay B)
BEMÆRK: Følg producentens protokol (se materialetabellen).- Forbered Coplin krukker.
- Der fremstilles proteinase K (20 μg/ml fortyndet i PBS).
- Efter afvoksning og rehydrering af sektionerne (trin 1.3) anbringes diasene i PBS i 5 min.
- Anbring diasene fladt i beholderen og tilsæt proteinase K (20 μg/ml, 60 μL pr. 5 cm² prøve).
- Vask rutsjebanerne 2 x 2 min i destilleret vand.
- Sluk i endogen peroxidase (i 3% hydrogenperoxidase) ved stuetemperatur.
- Skyl rutsjebanerne 2 x 5 min med PBS eller vand.
- Anbring diasene fladt i beholderen, og påfør ligevægtsbuffer (75 μL/5 cm2) i 10 s ved stuetemperatur.
- Tør forsigtigt rundt om vævet.
- TdT-enzymet (terminal deoxynukleotidyltransferase) tilsættes til hver sektion og inkuberes i et befugtet kammer i 1 time ved 37 °C. Læg papirhåndklæder inde i bakken, rundt om diasene, fugt håndklæderne med vand og dæk dem med plastfolie.
- Efter inkubation sættes prøverne i stativet og efterlades i stop/vaskebuffer (10 min).
- Varm anti-digoxigeninkonjugatet til stuetemperatur.
- Vask diasene i PBS (3 x 1 min).
- Tør forsigtigt af omkring vævet.
- Tilsæt to dråber anti-digoxigenin-peroxidasekonjugat (65 μL/5 cm²) til sektionerne og inkuberes i 30 minutter i en befugtet beholder.
- Efter vask i PBS 4 x 2 minutter skal du forberede peroxidasesubstrat med arbejdsstyrke og forsigtigt tappe overskydende væske og aspirere rundt om sektionen.
- Dæk sektionerne med peroxidasesubstrat (75 μL/5 cm²) og plet i 5 min. Placer et dias under mikroskopet og bestem den optimale farvningstid.
- Vask rutsjebanerne i et farvningsstativ i destilleret vand (3 x 1 min).
- Inkuber rutsjebanerne i destilleret vand i 5 min.
- Modfarve ved hjælp af hæmatoxylin i 2 min.
- Placer rutsjebanen under rindende postevand i 3 min.
- Vask diaset i destilleret vand.
- Monter diasene under glasdæksler i monteringsmedium og lad det tørre fladt.
- Overhold under et lysmikroskop.
- Apoptose detektionssæt (Assay C)
BEMÆRK: Følg producentens protokol (se materialetabellen).- Forbered Coplin-krukkerne.
- Afvoks og rehydrer vævsafsnittene (se trin 1.3).
- Inkubere vævet med proteinase K (15-30 min ved 37 °C).
- Læg slides tilbage på stativet og skyl 2x i PBS.
- Dæk med 50 μL 'TUNEL-reaktionsblanding'. Læg våde køkkenrulle inde i beholderen, dæk dem med plastfolie, og lad dem stå i 60 minutter ved 37 °C.
- Skyl 3x med PBS.
- Anbring diasene i beholderen og tør området omkring vævsprøven.
- Der tilsættes 50 μL Converter-AP til prøven, og der inkuberes i en befugtet beholder i 30 minutter ved 37 °C.
- Skyl 3x i PBS.
- Tilsæt 50-100 μL substratopløsning og lad det stå i 10 minutter i mørke.
BEMÆRK: Overhold farvningen under et lysmikroskop. - Skyl diasene 3x med PBS.
- Modfarvning ved at overføre sektioner til hæmatoxylin i 2 minutter og skyl derefter forsigtigt i rindende ledningsvand i 5 min.
- Monter diasene under glasdæksler i et vandigt monteringsmedium, og lad dem tørre fladt.
- Overhold under et lysmikroskop. Vurder de berørte (positive) celler ved at tælle 70 til 100 celler i hver prøve af midgut eller HPG'er under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Påvisning af celledød i midgut
Nyopståede arbejderbier (Apis mellifera carnica) fra den eksperimentelle bigård ved Sloveniens landbrugsinstitut i Ljubljana blev individuelt behandlet med 3 % oxalsyre (OA)23. OA bruges ofte i biavl til Varroa destructor kontrol. Efter behandlingen blev arbejderbierne (tre fra hver gruppe) immobiliseret på is. Midgut blev dissekeret og fikseret det i 10% formalin. Vævet blev derefter dehydreret i en række alkoholopløsninger og til sidst indlejret i paraffinvoks. Efter at være blevet skåret med et mikrotom i 7 μm tynde sektioner, blev vævsprøverne forberedt til analyse. Ved hjælp af et lysmikroskop blev procentdelen af berørte celler (70-100 celler fra hver af tre midgutprøver) beregnet. Resultaterne med Assay B indikerede, at behandling med OA signifikant påvirkede cellerne i midgut (figur 3). Assay A viste ingen forskel mellem behandlede og kontrolbier; Hyppigheden af celledød var under 10%. I kontrolbier, kun fodret med sukkersirup, var midgutens morfologi upåvirket og velbevaret.
Figur 3: Midgut. (A) Hæmatoxylin og eosin farvning; (B) immunostaining (Assay C) af midgut. Intens rød farvning er lokaliseret i kernerne i midgutcellerne. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Registrering af celledød i HPG'er
I det næste forsøg blev eksperimentet udført og valgte tre sygdomsfrie kolonier (Apis mellifera L.). Kamme med overdækket yngel blev anbragt i en inkubator (34,5 °C), og de nyopståede arbejderbier blev markeret med en plet på brystkassen for at definere deres alder. Denne procedure blev gentaget tre gange for at opnå forskellige ældre bier. Bierne blev mærket og vendte tilbage til deres koloni. Bierne blev udtaget prøver efter 30 dage fra forsøgets begyndelse. Til sidst blev de anbragt i et hamstringsbur på 7,5 cm x 4 cm x 4 cm med trådnet på den ene side og opbevaret i en inkubator ved 28 °C.
Arbejdere blev behandlet med insekticid (imidacloprid) eller acaricid (coumaphos), begge opløsninger i subletale doser, eller sukkersirup som en kontrolgruppe10. Bierne fra forskellige grupper blev immobiliseret og HPG'erne dissekeret. En prøve bestod af tre til fem arbejdere fra samme gruppe for at opnå så mange celler som muligt. De berørte celler blev evalueret ved hjælp af immunohistologiske metoder. Positive røde kerner efter behandling med imidacloprid eller coumaphos blev bestemt i størstedelen af kirtelceller (figur 4), og kun sporadiske cellekerner viste brunt reaktionsprodukt fra de samme behandlede grupper. Kontrolgruppen havde ingen beskadigede HPG-celler.
Figur 4: Hypopharyngeal kirtler. (A) Hæmatoxylin og eosin farvning (B) immunostaining (Assay C). Rød farvning er lokaliseret i cellernes kerner. (C) Immunostaining (assay B). Brunt reaktionsprodukt indikerer de positive cellekerner. Vægtstænger = 50 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I levende organismer defineres celledød som apoptose eller nekrose25 og kan ledsages af autofagi26. Forskellen mellem apoptotiske og nekrotiske celler er, at apoptose er en form for programmeret celledød og forekommer i normale celler, mens nekrose opstår på grund af dødelige tilstande (f.eks. ulykke, sygdom)27,28. Apoptose kan detekteres ved hjælp af assaysæt baseret på TUNEL-teknikken (påvisning afDNA-fragmentering ved at mærke 3′-hydroxyltermini i dobbeltstrengede DNA-pauser genereret under apoptose). Forskellige sæt giver flere niveauer af følsomhed ved detektering af cellesletning.
Et af assays (Assay C) er meget følsomt og registrerer både apoptose og nekrose29; det andet assay (B) viser højere følsomhed til påvisning af apoptotisk celledød30. Princippet om assay C er at detektere DNA-brud i de tidlige stadier af apoptose. Efter fastgørelse og permeabilisering af de apoptotiske celler inkuberes vævet med en TUNEL-reaktionsblanding. I mellemtiden er TdT's rolle at katalysere tilsætningen af fluorescein-dUTP ved frie 3′-OH-grupper i DNA. Efter at vævet er vasket, markerer antifluorescen-antistoffet etiketten i de beskadigede dele af DNA'et. Antistoffets princip er at binde sig til enzymet alkalisk fosfatase, der fungerer som reporter. Endelig kan AP ses som et resultat af denne specifikke reaktion31.
Haematoxylin og eosin farvning af organer er en ligetil og nyttig metode til morfologisk analyse ved hjælp af lysmikroskopi. Inkludering af dette trin først for at observere eventuelle morfologiske ændringer af celler anbefales. Til påvisning af tidlige stadier af apoptose i de tynde sektioner af honningbivæv er mindst to sæt tilgængelige til immunohistokemisk analyse (se materialetabellen). Begge gør de apoptotiske cellekerner mørkebrune og visualiseres ved hjælp af lysmikroskopi. Ved hjælp af assay A (TUNEL-teknik) konjugerer Streptavidin HRP (peberrodsperoxidase) til biotinylerede nukleotider, og apoptotiske kerner bliver brune efter reaktionen af DAB (diaminobenzidin, et stabilt kromogen). Assay B skelner mellem celleskader via påvisning af DNA-spaltning og kondenseret kromatin, hvilket er et tegn på tidlig apoptose.
I en sund organisme kan niveauet af cellefornyelse normalt vurderes i små procentdele32,33. Celledød i midgut steg efter OA-behandlingen, hvilket indikerer, at brugen af OA har en skadelig virkning på arbejderbiernes midguts i laboratorieforsøg. Gruppen af bier behandlet med imidacloprid og coumaphos afslørede en øget celledød (røde kerner) i fødekirtlerne10, hvilket indikerer celleskade eller nekrose; programmeret celledød blev fundet på et lavt niveau (brune kerner)10. Imidlertid blev nekrotisk og apoptotisk celledød fundet på høje niveauer, især efter imidaclopridbehandling. I gruppen af ubehandlede bier var niveauet af programmeret celledød i HPG'er ikke mere end 10%, hvilket er i overensstemmelse med normal vævsomsætning32.
Celledød, både på grund af skade eller programmeret celledød, blev detekteret ved begge assays (B og C) og resulterede i forskellig følsomhed; den første registrerer både nekrotisk og programmeret celledød11. Som bekræftet i de raske arbejdere (kontrolgruppe) påviste begge assays kun sporadiske positive celler10. Apoptose- og nekrosedetektionsassays, der blev anvendt i immunohistokemisk analyse af honningbivæv, viste sig at være en kraftfuld metode til at undersøge de subletale virkninger af forskellige stoffer på honningbier.
Kritiske trin i protokollen:
Efter at være blevet skåret med et mikrotom skal vævssektioner placeres på målglasset på en varm plade (udfladningsbord, se Materialetabel) natten over. Det er vigtigt, at prøverne tørres godt til fremtidige trin i protokollerne. Når væv ikke er godt fastgjort til glasset, kan det løsne sig fra overfladen i proceduren for påvisning af celledød. Det anbefales at bruge lysmikroskopet til at verificere tilstedeværelsen af det ønskede væv. Dernæst er det nyttigt at farve det første dias med H&E for at kontrollere det korrekte afsnit med mange celler (især kirtelvævet) og forberede nye, hvis midgut-sektionen ikke er passende. HPG'er kan være ret udfordrende at finde, så man skal passe på ikke at skære for mange sektioner; Ellers vil kirtlerne gå tabt.
Tilføjelse af positiv kontrol til at detektere DNA-fragmentering er nyttig, men valgfri. Det er vigtigt at behandle diasene separat for at undgå høj baggrundsfarvning i de eksperimentelle dias. I assay B er de positive kontroller inkluderet i nogle af sættene (se Materialetabel); andre skal købes separat.
Metoden har en begrænsning i sin længde og præcision. Konservering af væv i et vandigt monteringsmedium er kun kortvarigt (under 3 måneder). Hvis der ønskes længere konservering (anbefales ikke på grund af mulige farveændringer), er der andre medier, men resultaterne er ikke så pålidelige.
Brug af disse to metoder (apoptose og nekrosedetektion) samtidigt er meget nyttigt til at sammenligne de forskellige virkninger af pesticider på honningbivæv, især for subletale virkninger. Den alternative metode ville være observation af fourageringsaktivitet og dens indvirkning på den kognitive opfattelse af arbejderbier, der er påvirket af pesticider. En sådan metode ville være hurtigere til at opdage subletale virkninger på voksne biers aktiviteter, men ville ikke besvare spørgsmål vedrørende omfanget af den indre skade, der kan ændre adfærd i det tidlige stadium, som hos unge (sygeplejerske) bier.
Histologisk analyse af honningbivævets simple morfologi er et solidt grundlag for at nærme sig forskellige forskningsperspektiver inden for celleskader, apoptose eller misdannelser. Årsagerne til pesticidanvendelse i miljøet eller kolonibehandling på grund af parasitter og skadedyr kan være skadelige og påvirke honningbiernes levetid og kolonioverlevelse betydeligt. Midgut og HPG'er er vigtige organer i honningbier og har evnen og formålet med hurtigt at reagere på enhver form for negative eksterne faktorer, der påvirker biernes aldersrelaterede aktiviteter. HPG'erne falder i størrelse og sekretionsevner, og epitelceller i midgut reagerer ved øget celledød. Immunohistokemiske metoder, såsom in situ-undersøgelser , er nyttige værktøjer til apoptosedetektion i bivæv. De viser også potentialet for at blive implementeret i undersøgelser af mulige negative virkninger på honningbier og andre gavnlige insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Jeg anerkender taknemmeligt støtten fra det slovenske forskningsagentur, bevilling nr. P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
