Summary
Les méthodes immunohistochimiques sont utiles dans la recherche sur les abeilles mellifères pour détecter et évaluer le niveau d’apoptose et de nécrose dans l’intestin moyen et les glandes hypopharyngées des abeilles adultes.
Abstract
Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) à l’intérieur de la ruche (ouvrières nourricières et autres abeilles de la ruche) et à l’extérieur de la ruche (butineuses) sont exposées aux changements climatiques et météorologiques, à divers pesticides, agents pathogènes et à la malnutrition, pénétrant principalement par la bouche et affectant principalement le tube digestif des abeilles adultes. Pour comprendre et prévenir les effets de ces facteurs de stress externes et internes sur les abeilles, une méthode de recherche utile est la méthode immunohistochimique. Un protocole de base est décrit pour préparer l’intestin moyen (ventriculus) et les glandes hypopharyngées (HPG) des abeilles adultes pour l’analyse histologique. Une méthodologie détaillée est décrite pour évaluer le niveau de dommages cellulaires et distinguer la nécrose de la mort cellulaire programmée (apoptose) en tant que processus naturel de régénération tissulaire. Les résultats du traitement des abeilles adultes avec de l’acide oxalique et des pesticides (insecticide et acaricide) et la détermination de la mort cellulaire dans le ventriculus et les HPG sont présentés. Les avantages et les inconvénients de la méthodologie sont également discutés.
Introduction
Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) sont, entre autres pollinisateurs sauvages, les pollinisateurs les plus importants des plantes agricoles. Pendant des milliers d’années, l’environnement changeant a incité les abeilles à adapter leur morphologie, leur physiologie, leur comportement et leur tolérance à plusieurs agents pathogènes et parasites. Par conséquent, les abeilles mellifères ont développé une gamme très diversifiée d’espèces et de sous-espèces dans le mondeentier 1. Ces résultats sont cohérents avec les résultats précédents, qu’il existe une variation génétique dans la structure du tube digestif de l’abeille, mais suggèrent également que les altérations de l’intestin moyen sont dues à des facteurs environnementaux 2,3.
Le tube digestif de l’abeille a trois parties principales: l’intestin antérieur, l’intestin moyen (ventriculus) et l’intestin postérieur4. Le ventriculus est un organe essentiel pour la digestion du pollen et du nectar/miel ; Dans l’intestin postérieur, le contrôle osmotique a lieu par absorption d’eau et d’ions2. Les glandes hypopharyngées (HPG) des ouvrières apicoles sont situées dans la tête et synthétisent et sécrètent des composants de gelée royale pour nourrir la couvée, la reine et les membres de la colonie. Leur taille change avec l’âge et les tâches et dépend d’une bonne nutrition (pollen de qualité). Les infirmières et infirmiers âgés de 6 à 18 jours effectuent l’élevage des couvées, et la taille des HPG augmentede 5,6. Chez les abeilles butineuses, les HPG dégénèrent et ne sécrètent que les enzymes importantes pour convertir les sucres complexes en sucres simples (α-glucosidases, leucine arylamidase, invertase) dans le miel7.
Les abeilles mellifères sont exposées à plusieurs facteurs de stress biotiques et abiotiques8, et le tube digestif peut être affecté par plusieurs stimulants négatifs. La première barrière qui protège l’organisme contre les agents pathogènes est la membrane péritrophique de l’intestin moyen, constituée de muqueuse intestinale pour protéger contre les agents pathogènes4. Le développement et la fonction des HPG dépendent de l’alimentation, de l’âge et de l’état de la colonie9, et sont affectés par les insecticides, les acaricides 10 et les agents pathogènes11,12,13. Les résidus d’acaricides dans la ruche dus au traitement de lutte contre le varroa et aux pesticides de l’environnement affectent les abeilles butineuses et les abeilles nourrices14,15. La plus grande menace pour les colonies d’abeilles mellifères est l’acarien Varroa destructor, à la fois en tant que vecteur de virus contribuant aux pertes de colonies16 et en tant que consommateur du corps adipeux de l’hôte (un organe vital important chez les abeilles mellifères), ce qui affecte par conséquent le corps de l’individu et les fonctions de la colonie17.
Cependant, les habitats agricoles intensifs peuvent fournir un approvisionnement alimentaire à court terme pour les abeilles mellifères. Par conséquent, les programmes agroenvironnementaux devraient améliorer la disponibilité des fleurs mellifères dans les paysages agricoles18. Pour évaluer la morphologie de différentes sous-espèces 6,19,20,21 ou les effets sublétaux de ces facteurs au niveau des cellules ou des tissus, en particulier l’intestin moyen et les HPG, les méthodes histologiques et immunohistochimiques sont pratiques et suffisamment précises pour être utilisées dans la recherche histologique sur les abeilles.
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Protocol
1. Histologie de base pour la recherche sur les abeilles mellifères
- Dissection de tissus d’abeilles mellifères
REMARQUE : Pour la dissection des abeilles ouvrières, utilisez un microscope à dissection muni d’une source lumineuse DEL. Le grossissement le plus utile est ~20x.- Manipulation et dissection
- Prendre soigneusement une abeille ouvrière avec une pince et la mettre sur de la glace (ou au congélateur à -20 °C) pendant 2 min pour l’immobiliser22. Épinglez l’abeille sur la boîte de Petri en diagonale à travers la partie supérieure arrière du thorax deux fois, de gauche à droite et de droite à gauche.
- Versez une solution saline d’insecte pour couvrir le corps. Placez la boîte de Petri sous le microscope, faites la mise au point et ajustez.
- Préparez les instruments (voir le tableau des matériaux).
- Dissection de l’intestin moyen
- Commencez par l’abdomen en insérant un point des ciseaux sous le tergite A5 (Figure 1) au centre du côté droit du corps de l’abeille. Couper au tergite A2.
- Gardez la lame interne des ciseaux parallèle au côté du corps pour éviter d’endommager les organes internes. Tournez les ciseaux vers la gauche et faites une coupe; Tournez à droite et faites une autre coupe. Ouvrez doucement la partie gauche de l’abdomen et épinglez-la. Répétez de l’autre côté.
- À l’aide d’une pince, tirez doucement l’estomac de l’abeille vers le haut et, avec des ciseaux dans l’autre main, coupez à la toute extrémité de l’œsophage. Retirez l’estomac et l’intestin moyen de l’abdomen et coupez le rectum. Utilisez une pipette avec une solution saline d’insectes et retirez les matières fécales ou les parties du tissu.
- Dissection des HPG
- Immobiliser une abeille ouvrière sur la glace comme décrit à l’étape 1.1.1. Coupez la tête et placez-la sur la plus petite assiette avec les antennes tournées vers le haut. Fixez la tête avec deux broches: une à travers l’œil composé gauche et la seconde à travers l’œil composé droit.
- Faites une incision sur le premier œil composé sur la face interne des broches, continuez jusqu’au labrum, puis faites une autre coupe de l’autre côté à travers le deuxième œil composé (Figure 2).
- Coupez les antennes. Soulevez le masque et coupez là où il est encore attaché. Prenez les forceps et retirez soigneusement les glandes ainsi que le cerveau et une partie des yeux composés.
- Manipulation et dissection
- Fixation, déshydratation et encastrement de paraffine
REMARQUE : Portez des gants de protection.- Placez le mouchoir dans des flacons de pénicilline, remplis aux 3/4 avec 10% de formol. Conserver au réfrigérateur à 4 °C.
- Après 24 h, déshydrater le tissu dans une série d’alcools: 70%, 80%, 90%, 100%, pendant 1 h chacun, 100% 2-propanol pendant 1 h, 100% 2-propanol pendant 12 h, et enfin 100% 2-propanol pendant 1 h.
- Placer le tissu dans des histocassettes; marquez-les et placez-les dans les chambres vitrées avec du 2-propanol et de la paraffine (1:1) dans un incubateur à 60 °C pendant 24 h.
- Déplacer les histocassettes dans une autre chambre avec de la paraffine (I.) pendant encore 24 h. Répétez la procédure avec de la paraffine fraîche deux fois de plus (II. et III.), les deux pendant 24 h.
- Enfin, préparez la station de montage et commencez à incorporer le tissu dans de la cire.
- Ouvrez chaque histocassette et retirez le couvercle. Remplissez le moule avec de la cire et placez soigneusement le mouchoir avec une pince chaude au milieu du moule.
- Placez l’histocassette sur le moule et recouvrez-la légèrement de cire. Placez immédiatement le moule sur la surface froide de la station de montage pendant quelques secondes, puis placez-le sur la plaque froide pendant quelques minutes jusqu’à ce que la cire durcisse et se sépare du moule et de l’histocassette.
- Conservez les échantillons finis dans une boîte, à l’abri de la poussière et de la chaleur.
- Couper des sections minces de 4 μm sur un microtome: d’abord, deux sections attachées l’une à l’autre, puis une séparément. Transférer les sections à l’aide d’une pince et les laisser flotter sur de l’eau distillée (42 °C), puis les recueillir sur des lames propres en plaçant deux sections ensemble sur le côté gauche du verre de l’objectif et la troisième sur le côté droit, en restant nettement séparées. Laissez les lames marquées pendant la nuit sur l’appareil de chauffage et enfin rangez-les dans une boîte dédiée aux échantillons d’histologie.
- Déparaffinage et réhydratation
REMARQUE : Portez des gants de protection.- Préparer neuf pots Coplin et placer les sections dans une série d’agents de compensation (I., II., III.) pendant 5 minutes chacun.
- Mettre dans le 2-propanol, l’éthanol 96% (I., II.), l’alcool 90% et 80%, et l’eau distillée pendant 3 min chacun.
- Teinture à l’hématoxyline et à l’éosine
REMARQUE : Portez des gants de protection.- Préparez six pots Colin.
- Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), mettez les sections déparaffinées et réhydratées dans de l’hématoxyline pendant 5 minutes, puis placez-les soigneusement sous l’eau courante du robinet pendant 2 minutes. Ensuite, mettez-les dans de l’eau distillée pendant 1 min et de l’éosine pendant 4 min (pour l’éosine, le pot Coplin n’est pas nécessaire).
- Placer les lames dans de l’éthanol à 96% pendant 1 min, puis 2-propanol pendant 2 min, et enfin dans l’agent de nettoyage pendant 2 min.
- Ajoutez un support de montage et un verre de couverture et laissez-les sécher. Observez au microscope optique.
Figure 1 : Vue dorsale du corps de l’abeille. A1-A7 tergites. Les instructions détaillées sur la dissection des abeilles mellifères se trouvent dans Carreck et coll.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vue dorsale des HPG, parties des yeux composés attachées au cerveau (non visible). Une jeune abeille ouvrière âgée de 5 à 6 jours a des HPG dodus et blanc crème. Les acini sont situés sur le cerveau et remplissent la zone de la tête avec des branches atteignant l’arrière du cerveau. Chez les abeilles butineuses, ces glandes sont considérablement rétrécies et ne laissent que de minces restes filiformes. Pour cette raison, il est préférable d’enlever les glandes avec le cerveau pour faciliter les procédures ultérieures afin d’éviter de perdre le tissu. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Détection de la mort cellulaire dans les coupes tissulaires
- Kit de détection de l’apoptose (Dosage A)
REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).- Préparez les pots de Coplin.
- Après déparaffinage et réhydratation (voir étape 1.3), immerger les lames dans une solution de NaCl à 0,85 %, puis dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (5 min).
- Mettre les lames dans 4% de paraformaldéhyde 2 x 15 min.
- Placez les lames à plat dans le récipient et ajoutez 100 μL d’une solution de protéinase K (20 μg/mL), puis laissez-les pendant 10 à 30 minutes.
- Placez les diapositives dans PBS (5 min).
- Placer les lames dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (5 min).
- Immergez les diapositives dans PBS (2 x 5 min).
- Placez les lames à plat dans le récipient, ajoutez 100 μL de tampon d’équilibrage et laissez-les pendant 5-10 min.
- Ajouter 100 μL de mélange réactionnel TdT. Mettez des serviettes en papier à l’intérieur du récipient, autour des lames, humidifiez les serviettes avec de l’eau, puis recouvrez-les d’une pellicule de plastique. Incuber les toboggans pendant 60 min à 37 °C.
- Replacez les lames dans la grille de coloration et plongez dans 2x citrate de sodium salin (SSC) pendant 15 min.
- Immergez les diapositives 3 x 5 min dans du PBS, puis dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 3 à 5 min, puis à nouveau dans du PBS, 3 x 5 min.
- Encore une fois, placez les lames à plat dans le récipient, ajoutez 100 μL de streptavidine HRP (peroxydase de raifort) et laissez reposer 30 minutes (couvrir d’une pellicule de plastique).
- Immergez les diapositives 3 x 5 min dans PBS.
- Placer les lames à plat dans le récipient et ajouter 100 μL de solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Recherchez un fond brun clair.
- Remettez les lames sur la grille et lavez-les plusieurs fois à l’eau (double distillation).
- Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage et laissez sécher à plat.
- Observez au microscope optique.
- Kit de détection de l’apoptose (Dosage B)
REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).- Préparez les pots Colin.
- Préparer la protéinase K (20 μg/mL dilués dans du PBS).
- Après avoir déciré et réhydraté les sections (étape 1.3), placez les lames dans PBS pendant 5 min.
- Placer les lames à plat dans le récipient et ajouter la protéinase K (20 μg/mL, 60 μL par échantillon de 5 cm²).
- Laver les lames 2 x 2 min à l’eau distillée.
- Tremper dans la peroxydase endogène (dans 3% d’hydrogène peroxydase) à température ambiante.
- Rincer les lames 2 x 5 min avec du PBS ou de l’eau.
- Placer les lames à plat dans le récipient et appliquer un tampon d’équilibrage (75 μL/5 cm2) pendant 10 s à température ambiante.
- Essuyez soigneusement autour du tissu.
- Ajouter l’enzyme TdT (désoxynucléotidyl transférase terminale) à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 h à 37 °C. Mettez des serviettes en papier à l’intérieur du plateau, autour des diapositives, humidifiez les serviettes avec de l’eau et recouvrez-les d’une pellicule de plastique.
- Après l’incubation, mettre les échantillons dans la grille et les laisser dans un tampon d’arrêt/lavage (10 min).
- Réchauffer le conjugué anti-digoxigénine à température ambiante.
- Lavez les lames dans PBS (3 x 1 min).
- Essuyez soigneusement autour du mouchoir.
- Ajouter deux gouttes de conjugué anti-digoxigénine-peroxydase (65 μL/5 cm²) aux sections et incuber pendant 30 min dans un récipient humidifié.
- Après le lavage dans PBS 4 x 2 min, préparer le substrat de peroxydase de résistance au travail, puis tapoter doucement l’excès de liquide et aspirer autour de la section.
- Couvrir les sections avec un substrat de peroxydase (75 μL/5 cm²) et colorer pendant 5 min. Placez une lame sous le microscope et déterminez le temps de coloration optimal.
- Laver les lames dans une grille de coloration dans de l’eau distillée (3 x 1 min).
- Incuber les lames dans de l’eau distillée pendant 5 min.
- Contre-coloration à l’aide d’hématoxyline pendant 2 min.
- Placez la toboggan sous l’eau courante du robinet pendant 3 min.
- Lavez la lame à l’eau distillée.
- Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage et laissez sécher à plat.
- Observez au microscope optique.
- Kit de détection de l’apoptose (Dosage C)
REMARQUE : Suivez le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).- Préparez les pots de Coplin.
- Décirer et réhydrater les sections de tissu (voir étape 1.3).
- Incuber le tissu avec la protéinase K (15-30 min à 37 °C).
- Replacez les lames sur la grille et rincez 2x dans PBS.
- Couvrir de 50 μL de « mélange réactionnel TUNEL ». Placez les serviettes en papier humides à l’intérieur du récipient, recouvrez-les d’une pellicule plastique et laissez-les pendant 60 min à 37 °C.
- Rincer 3x avec du PBS.
- Placez les lames dans le récipient et séchez la zone autour de l’échantillon de tissu.
- Ajouter 50 μL de Converter-AP à l’échantillon et incuber dans un récipient humidifié pendant 30 min à 37 °C.
- Rincer 3x dans PBS.
- Ajouter 50-100 μL de solution de substrat et laisser reposer 10 min dans l’obscurité.
REMARQUE: Observez la coloration au microscope optique. - Rincez les lames 3x avec du PBS.
- Contre-colorer en transférant les sections dans l’hématoxyline pendant 2 min, puis rincer soigneusement à l’eau courante du robinet pendant 5 min.
- Montez les glissières sous des lamelles de verre dans un support de montage aqueux et laissez-les à plat pour sécher.
- Observez au microscope optique. Évaluer les cellules affectées (positives) en comptant 70 à 100 cellules dans chaque échantillon de l’intestin moyen ou HPG au microscope optique.
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Representative Results
Détection de la mort cellulaire dans l’intestin moyen
Les abeilles ouvrières (Apis mellifera carnica) nouvellement issues du rucher expérimental de l’Institut agricole de Slovénie à Ljubljana ont été traitées individuellement avec de l’acide oxalique (OA) à 3 %23. L’arthrose est fréquemment utilisée en apiculture pour lutter contre Varroa destructor . Après le traitement, les abeilles ouvrières (trois de chaque groupe) ont été immobilisées sur de la glace. L’intestin moyen a été disséqué et fixé dans du formol à 10%. Le tissu a ensuite été déshydraté dans une série de solutions d’alcool et finalement incorporé dans de la cire de paraffine. Après avoir été coupés avec un microtome en sections minces de 7 μm, les échantillons de tissus ont été préparés pour analyse. À l’aide d’un microscope optique, le pourcentage de cellules affectées (70 à 100 cellules provenant de chacun des trois échantillons de l’intestin moyen) a été calculé. Les résultats du test B ont indiqué que le traitement par arthrose affectait de manière significative les cellules de l’intestin moyen (Figure 3). Le test A n’a montré aucune différence entre les abeilles traitées et les abeilles témoins; Le taux de mort cellulaire était inférieur à 10 %. Chez les abeilles témoins, nourries uniquement au sirop de sucre, la morphologie de l’intestin moyen n’était pas affectée et bien préservée.
Figure 3 : Intestin moyen. (A) coloration à l’hématoxyline et à l’éosine ; (B) immunomarquage (dosage C) de l’intestin moyen. Une coloration rouge intense est localisée dans les noyaux des cellules de l’intestin moyen. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Détection de la mort cellulaire dans les HPG
Dans l’essai suivant, l’expérience a été menée, en sélectionnant trois colonies exemptes de maladie (Apis mellifera L.). Des peignes avec couvain couvert ont été placés dans un incubateur (34,5 ° C), et les abeilles ouvrières nouvellement apparues ont été marquées d’une tache sur le thorax pour définir leur âge. Cette procédure a été répétée trois fois pour obtenir des abeilles d’âge différent. Les abeilles ont été marquées et retournées dans leur colonie. Les abeilles ont été échantillonnées 30 jours après le début de l’essai. Enfin, ils ont été placés dans une cage de palissade de 7,5 cm x 4 cm x 4 cm, avec un treillis métallique d’un côté et conservés dans un incubateur à 28 °C.
Les travailleurs ont été traités avec un insecticide (imidaclopride) ou un acaricide (coumaphos), les deux solutions à des doses sublétales, ou du sirop de sucre comme groupe témoin10. Les abeilles de différents groupes ont été immobilisées et les HPG disséquées. Un échantillon était composé de trois à cinq travailleurs du même groupe pour obtenir autant de cellules que possible. Les cellules affectées ont été évaluées à l’aide de méthodes immunohistologiques. Des produits de réaction rouges (dosage C) et bruns (essai B) ont été détectés dans les noyaux apoptotiques des HPG. Des noyaux rouges positifs après un traitement par imidaclopride ou coumaphos ont été déterminés dans la majorité des cellules glandulaires (Figure 4), et seuls les noyaux de cellules sporadiques présentaient un produit de réaction brun provenant des mêmes groupes traités. Le groupe témoin n’avait pas de cellules HPG endommagées.
Figure 4 : Glandes hypopharyngées. (A) coloration à l’hématoxyline et à l’éosine; (B) immunomarquage (dosage C). La coloration rouge est localisée dans les noyaux des cellules. c) immunomarquage (dosage B). Le produit de réaction brun indique les noyaux cellulaires positifs. Barres d’échelle = 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans les organismes vivants, la mort cellulaire est définie comme l’apoptose ou la nécrose25 et peut être accompagnée d’autophagie26. La différence entre les cellules apoptotiques et nécrotiques est que l’apoptose est une forme de mort cellulaire programmée et apparaît dans les cellules normales, alors que la nécrose se produit en raison de conditions mortelles (p. ex. accident, maladie)27,28. L’apoptose peut être détectée à l’aide de kits de dosage basés sur la technique TUNEL (détection de la fragmentation de l’ADN par marquage des terminus 3′-hydroxyle dans les cassures d’ADN double brin générées lors de l’apoptose). Différents kits offrent plusieurs niveaux de sensibilité dans la détection de la délétion cellulaire.
L’un des tests (test C) est très sensible et détecte à la fois l’apoptose et la nécrose29; l’autre test (B) montre une sensibilité plus élevée pour détecter la mort cellulaire apoptotique30. Le principe du test C est de détecter les cassures de l’ADN dans les premiers stades de l’apoptose. Après fixation et perméabilisation des cellules apoptotiques, le tissu est incubé avec un mélange réactionnel TUNEL. Pendant ce temps, le rôle de TdT est de catalyser l’ajout de fluorescéine-dUTP aux groupes 3′-OH libres dans l’ADN. Après le lavage du tissu, l’anticorps anti-fluorescéine marque l’étiquette dans les parties endommagées de l’ADN. Le principe de l’anticorps est de se fixer à l’enzyme phosphatase alcaline qui fonctionne comme un rapporteur. Enfin, l’AP peut être vu comme le résultat de cette réaction spécifique31.
La coloration des organes à l’hématoxyline et à l’éosine est une méthode simple et utile pour l’analyse morphologique par microscopie optique. Il est recommandé d’inclure cette étape en premier pour observer tout changement morphologique des cellules. Pour la détection des stades précoces de l’apoptose dans les sections minces du tissu des abeilles, au moins deux trousses sont disponibles pour l’analyse immunohistochimique (voir le tableau des matériaux). Les deux transforment les noyaux des cellules apoptotiques en brun foncé et sont visualisés par microscopie optique. En utilisant le test A (technique TUNEL), la streptavidine HRP (peroxydase de raifort) se conjugue aux nucléotides biotinylés, et les noyaux apoptotiques brunissent après la réaction de DAB (diaminobenzidine, un chromogène stable). Le test B distingue les dommages cellulaires par la détection du clivage de l’ADN et de la chromatine condensée, ce qui est un signe d’apoptose précoce.
Dans un organisme sain, le niveau de renouvellement cellulaire peut généralement être évalué en petits pourcentages32,33. La mort cellulaire dans l’intestin moyen a augmenté après le traitement de l’arthrose, ce qui indique que l’utilisation de l’arthrose a un effet néfaste sur l’intestin moyen des abeilles ouvrières dans les expériences de laboratoire. Le groupe d’abeilles traitées à l’imidaclopride et au coumaphos a révélé une augmentation de la mort cellulaire (noyaux rouges) dans les glandes alimentaires10, indiquant une lésion cellulaire ou une nécrose ; La mort cellulaire programmée a été trouvée à un faible niveau (noyaux bruns)10. Cependant, la mort cellulaire nécrotique et apoptotique a été observée à des niveaux élevés, en particulier après un traitement par imidaclopride . Dans le groupe des abeilles non traitées, le niveau de mort cellulaire programmée dans les HPG n’était pas supérieur à 10%, ce qui est conforme au renouvellement tissulaire normal32.
La mort cellulaire, à la fois due à des dommages ou à la mort cellulaire programmée, a été détectée par les deux tests (B et C) et a entraîné une sensibilité différente; Le premier détecte à la fois la mort cellulaire nécrotique et programmée11. Comme confirmé chez les travailleurs sains (groupe témoin), les deux tests n’ont détecté que10 cellules positives sporadiques. Les tests de détection de l’apoptose et de la nécrose utilisés dans l’analyse immunohistochimique des tissus d’abeilles mellifères se sont avérés être une méthode puissante pour explorer les effets sublétaux de différentes substances sur les abeilles.
Étapes critiques du protocole :
Après avoir été découpés avec un microtome, les coupes de tissu doivent être placées sur le verre objectif sur une assiette chaude (table d’aplatissement, voir Tableau des matériaux) pendant la nuit. Il est essentiel que les échantillons soient bien séchés pour les étapes futures des protocoles. Lorsque le tissu n’est pas bien attaché au verre, il peut se détacher de la surface dans la procédure de détection de la mort cellulaire. Il est conseillé d’utiliser le microscope optique pour vérifier la présence du tissu souhaité. Ensuite, il est utile de teindre la première lame avec H & E pour vérifier la bonne section avec de nombreuses cellules (en particulier le tissu glandulaire) et en préparer de nouvelles au cas où la section de l’intestin moyen ne serait pas appropriée. Les HPG peuvent être assez difficiles à trouver, il faut donc veiller à ne pas couper trop de sections; Sinon, les glandes seront perdues.
L’ajout d’un contrôle positif pour détecter la fragmentation de l’ADN est utile mais facultatif. Il est important de traiter les lames séparément pour éviter une coloration élevée du fond dans les lames expérimentales. Dans le test B, les témoins positifs sont inclus dans certaines trousses (voir le tableau des matériaux); d’autres doivent être achetés séparément.
La méthode a une limite dans sa longueur et sa précision. La conservation des tissus dans un milieu de montage aqueux n’est que de courte durée (moins de 3 mois). Si une conservation plus longue est souhaitée (non recommandée en raison de changements de couleur possibles), il existe d’autres supports, mais les résultats ne sont pas aussi fiables.
L’utilisation simultanée de ces deux méthodes (apoptose et détection de nécrose) est très utile pour comparer les différents effets des pesticides sur les tissus des abeilles, en particulier pour les effets sublétaux. La méthode alternative serait l’observation de l’activité de recherche de nourriture et de son impact sur la perception cognitive des abeilles ouvrières affectées par les pesticides. Une telle méthode serait plus rapide pour détecter les effets sublétaux sur les activités des abeilles adultes, mais ne répondrait à aucune question concernant l’étendue des dommages internes qui peuvent modifier le comportement à un stade précoce, comme chez les jeunes abeilles (nourrices).
L’analyse histologique de la morphologie simple des tissus d’abeilles mellifères est une base solide pour aborder différentes perspectives de recherche sur les dommages cellulaires, l’apoptose ou les malformations. Les causes de l’utilisation de pesticides dans l’environnement ou du traitement des colonies en raison de parasites et de ravageurs peuvent être préjudiciables et affecter considérablement la durée de vie des abeilles mellifères et la survie des colonies. L’intestin moyen et les HPG sont des organes essentiels chez les abeilles mellifères et ont la capacité et le but de réagir rapidement à tout type de facteurs externes négatifs qui affectent les activités liées à l’âge des abeilles. Les HPG diminuent en taille et en capacités de sécrétion, et les cellules épithéliales de l’intestin moyen répondent par une augmentation de la mort cellulaire. Les méthodes d’immunohistochimie, telles que les études in situ , sont des outils utiles pour la détection de l’apoptose dans les tissus des abeilles. Ils montrent également le potentiel d’être mis en œuvre dans les études sur les effets indésirables possibles sur les abeilles mellifères et d’autres insectes utiles.
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Disclosures
L’auteur n’a pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Je remercie l’Agence slovène de recherche, subvention n° P4-133, pour son soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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