Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64530
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,3, 3, 1,2
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

הפרוטוקול כאן מספק דגימה דינמית מפורטת בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מההיפוקמפוס של חולדות ערות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה.

Abstract

מגוון מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) קשורות לשינויים בהרכב הנוזל החוץ תאי בהיפוקמפוס (HECF). עם זאת, קושי בהשגת HECF בזמן אמת מחולדות מודעות הגביל זה מכבר את הערכת התקדמות המחלה במערכת העצבים המרכזית ואת יעילות הטיפול האתנו-רפואי. באופן מעודד, ניתן להשתמש בטכניקת מיקרודיאליזה מוחית לדגימה רציפה עם היתרונות של תצפית דינמית, ניתוח כמותי וגודל דגימה קטן. זה מאפשר ניטור של שינויים בתכולת הנוזל החוץ תאי עבור תרכובות מצמחי מרפא מסורתיים והמטבוליטים שלהם במוחם של בעלי חיים חיים. מטרת מחקר זה הייתה להשתיל במדויק גשושית מיקרודיאליזה של נוזל מוחי שדרתי באזור ההיפוקמפוס של חולדות Sprague Dawley (SD) עם מנגנון סטריאוטקסי תלת-ממדי במוח, תוך חיתוך משקלים מולקולריים הגדולים מ-20 kDa. ה-HECF האיכותי התקבל מחולדות מודעות באמצעות מערכת בקרת דגימת מיקרודיאליזה עם קצב דגימה מתכוונן מ-2.87 nL/min - 2.98 מ"ל/דקה. לסיכום, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה, מהירה ודינמית להשגת HECF בחולדות ערות בעזרת טכנולוגיית מיקרודיאליזה, המספקת לנו אפשרויות בלתי מוגבלות להמשיך לחקור את הפתוגנזה של מחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית ולהעריך את יעילות התרופות.

Introduction

מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם תחלואה גבוהה, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, פגיעה מוחית טראומטית, פגיעה מוחית הנגרמת על ידי היפוקסיה בגובה רב ושבץ איסכמי, הן סיבות מכריעות לתמותה הגוברת ברחבי העולם 1,2,3. ניטור בזמן אמת של ציטוקינים ושינויים חלבוניים באזורים מסוימים במוח תורם לדיוק האבחנתי של מחלות CNS ומחקרים פרמקוקינטיים במוח לאחר תרופות. המחקר המדעי המסורתי משתמש בהומוגנט של רקמת המוח או באוסף ידני של נוזל מוח אינטרסטיציאלי של בעלי חיים לזיהוי חומרים ספציפיים ולמחקרים פרמקוקינטים. עם זאת, יש לכך כמה חסרונות, כגון גודל מדגם מוגבל, חוסר היכולת לצפות באופן דינמי בשינויים של אינדיקטורים, ואיכות דגימה לא אחידה 4,5,6. נוזל מוחי שדרתי, נוזל אינטרסטיציאלי, מגן על המוח וחוט השדרה מפני נזק מכני. הרכבו שונה מזה של הסרום בשל קיומו של מחסום הדם-מוח (BBB)7. ניתוח ישיר של דגימות נוזל מוחי שדרתי תורם יותר לחשיפת המנגנון של נגעים במערכת העצבים המרכזית וגילוי תרופות. באופן בלתי נמנע, דגימות נוזל המוח השדרה, המתקבלות באופן ידני ישירות מן cisterna magna וחדרי המוח דרך מזרק, יש חסרונות של זיהום דם, סיכוי אקראי של איסוף דגימה, אי ודאות של כמות, וכמעט ללא אפשרות שליפה מרובה 8,9. חשוב מכך, שיטות דגימה קונבנציונליות של נוזל מוח אינטרסטיציאלי אינן יכולות להשיג דגימות מאזורי מוח פגועים, מה שמעכב את חקר הפתוגנזה של מחלות CNS באזורי מוח ספציפיים ואת הערכת היעילות של טיפולים אתנו-רפואיים ממוקדים 9,10.

מיקרודיאליזה מוחית היא טכניקה לדגימת נוזל מוח אינטרסטיציאלי בחיות ערות11. מערכת המיקרודיאליזה מחקה חדירות כלי דם בעזרת בדיקה שהושתלה במוח. בדיקת המיקרודיאליזה חמושה בקרום חדיר למחצה ומושתלת באזורי מוח ספציפיים. לאחר זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי איזוטוני (ACSF), נוזל המוח הבין-תאי החוגג יכול להיאסף לטובה עם היתרונות של גודל מדגם קטן, דגימה רציפה ותצפית דינמית12,13. במונחים של מיקום, בדיקות מיקרודיאליזה במוח יכולות להיות מושתלות באופן סלקטיבי במבני מוח או בורות גולגולת מעניינים14. תצפית על רמות חריגות של חומר אנדוגני בנוזל החוץ תאי בהיפוקמפוס (HECF) מצביעה על התרחשויות של מחלות CNS או פתוגנזה של מחלות. מספר מחקרים הראו כי הסמנים הביולוגיים למחלות CNS, כגון חומצות אמינו D בסכיזופרניה, חלבוני β-עמילואיד וטאו במחלת אלצהיימר, שרשראות אור נוירופילמנט בפגיעה מוחית טראומטית, ויוביקוויטין קרבוקסי-טרמינל הידרולאז L1s באנצפלופתיה איסכמיה היפוקסית, ניתנים לניתוח בנוזל השדרה15,16,17 . שיטת אנליזה כימית המבוססת על טכניקת דגימת מיקרודיאליזה במוח יכולה לשמש למעקב אחר שינויים דינמיים של תרכובות אקסוגניות כגון חומרים פעילים של אתנורפואה, אשר מתפזרים ומפיצים באזורים ספציפיים במוח14.

מאמר זה מציג את התהליך הספציפי של רכישת HECF דינמי בחולדות ערות ומודד את הלחץ האוסמוטי שלו כדי להבטיח את איכות הדגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול הניסוי נערך בהתאם לדרישות הוועדה לטיפול ושימוש מוסדי בחיות מעבדה באוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר שיא: 2021-11). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות זכרים מסוג Sprague Dawley (SD) (280 ±-20 גרם, בני 6-8 שבועות).

1. ניתוח השתלת בדיקת מיקרודיאליזה במוח

  1. השתמשו באיזופלורן 3% ו-1.5% להשראת הרדמה של חולדות ותחזוקתן, בהתאמה, באמצעות מערכת הרדמה של בעלי חיים בתערובת אוויר-חמצן במינון של 0.6 ליטר/דקה. ודאו שהחולדות מורדמות עמוקות ללא רפלקס כאב ורפלקס קרנית. השתמש משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
  2. הסירו את הפרווה על גולגולת החולדה המורדמת בעזרת מכונת גילוח חשמלית באזור ההכנה. לאחר מכן, תקנו את החולדה המורדמת במאתר מוח סטריאוטקסי. לחטא את אתר הניתוח לפני הניתוח על ידי החלת פובידון-יוד ואתנול 3x לאזור הניתוח עם כדור צמר גפן סטרילי. החל bupivacaine מקומי עבור שיכוך כאבים מקומי. הערה: כל התהליך של רכישת דגימת HECF מבוססת מיקרודיאליזה מתואר באיור 1.
  3. בצע חתך גולגולתי של 1.5 ס"מ באמצע עם מספריים כירורגיים והסר את הפריאוסטאום באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים עיניים.
  4. חשבו על הברגמה כמיקום הבסיסי ונקבו את האנדוקרניום כדי לקדוח צמצם של 2 מ"מ במיקום הקדמי (AP) (-2 מ"מ), המיקום הבינוני (ML) (-3.5 מ"מ), והמיקום הדורסו-ונטרלי (DV) (-3.5 מ"מ) (אזור CA1 בהיפוקמפוס) באמצעות מקדח גולגולתי.
  5. תקן את סגנון הצנתר על ידית האחיזה של מאתר מוח סטריאוטקסי והתאם את מיקום מעטפת המיקרודיאליזה במיקומים AP ( -2 מ"מ), ML ( -3.5 מ"מ) ו- DV (0 מ"מ). התאם את ערך ה- DV של מאתר הסטריאו במוח, והשתיל את מעטפת המיקרודיאליזה באזור CA1 בעומק של 3.5 מ"מ.
    הערה: יש לשמור על טמפרטורת בעל החיים ב-37°C במהלך הפעולה באמצעות מתחזק טמפרטורת בעל חיים.
  6. קדחו שלושה פתחים נוספים בקוטר 2 מ"מ כך ששלושת הצמצמים יוצרים משולש שבו צמצם הגשושית ממוקם במרכז. השתלת ברגים לתוך הצמצמים בעומק של 1 מ"מ.
  7. תקן את קטטר הבדיקה עם מלט דנטלי והשתמש בתפר כירורגי 4-0 כדי לסגור את העור. ראו איור 2 למיקום הגשושית.
  8. הכניסו את החולדה לכלובים למשך 7 ימים כדי להחלים. חדירה מקומית bupivacaine (1.5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום לאחר הניתוח.  לספק מזון ומים עד ליביטום. השתמש טיפות עיניים hyaluronate נתרן 3 פעמים ביום כדי למנוע יובש לאחר הניתוח.
    הערה: בצע את כל הפרוצדורות בחדר ניתוח סטרילי. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה במצב של 37 מעלות צלזיוס. אין להחזיר את בעל החיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.

2. חיבור מערכת מיקרודיאליזה ובדיקת בדיקה

  1. חבר את משאבת המיקרודיאליזה, המזרק, מכשיר הפעילות הער ואוסף הדגימות הקריוגניות בהתאם להוראות היצרן. התקן את המיקרומזרק עם ACSF על משאבת המיקרודיאליזה והגדר את משאבת המיקרודיאליזה לקצב של 1 מיקרוליטר לדקה כדי לפרוק את האוויר בצנרת.
  2. חבר את הצינור ואת בדיקת מיקרודיאליזה במוח (ממברנה: PAES; אורך הממברנה: 4 מ"מ; OD ממברנה: 0.5 מ"מ; חיתוך: 20 kDa; אורך פיר: 14 מ"מ). הפעל את משאבת המיקרודיאליזה בקצב של 1 μL/min כדי להזריק ACSF לתוך הבדיקה עד שפני השטח של הבדיקה לחים מעט. לטבול את הבדיקה בתמיסת הזרקת נתרן הפרין לשימוש לאחר מכן.
    הערה: אם זרם גדול של ACSF נופל מהקרום החדיר למחצה של הגשושית, כפי שנראה בעין בלתי מזוינת תחת כוח הכבידה, החלף את הגשושית בחדשה.

3. איסוף HECF מהחולדה העירה

  1. הכניסו את בדיקת המיקרודיאליזה של המוח לתוך צנתר הבדיקה והכניסו את החולדה לתא (גובה: 360 מ"מ, קוטר: 400 מ"מ) עם ריפוד כדי לוודא שהחולדות חופשיות לנוע.
  2. חברו את הצינור, משאבת המיקרומזרק ובדיקת המיקרודיאליזה במוח. רתמו את החולדה דרך החור בחלק העליון של מתקן ריסון החולדות והנירוסטה מסתובבת.
  3. הפעל את בקר הסיבוב הרב-ערוצי כדי למנוע שזירה של צינורות המיקרודיאליזה במהלך התנועה החופשית של החולדה. הפעל את משאבת המיקרומזרק ושאב את ACSF בקצב של 1 μL/min. יש לאסוף HECF מעת לעת לאחר שיווי משקל של 60 דקות של מערכת איסוף HECF של מיקרודיאליזה.
  4. ודא שקצב הזרימה של דגימות HECF באספן המקטעים המקורר תואם לעירוי ACSF. אסוף 20 μL של HECF ושנה אוטומטית לצינור הדגימה הבא. יש להקפיד לבדוק האם קרום הבדיקה פגום בעת החדרת הבדיקה.

4. מדידת הלחץ האוסמוטי עבור HECF

  1. הפעל את האוסמומטר והיכנס למערכת האיתור. לחץ על כפתור Cal במסך המגע ולחץ על כפתור Res בדף כדי לנקות את זיכרון הכיול הקודם.
  2. התקן צינור 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של מים טהורים ללא בועות על ראש המדידה. משוך את ראש המדידה לתחתית מיכל ההידרזין הקר.
  3. הזן את מספר הדגימה 0 במסך המגע ואשר לבדיקה. טבלו במהירות את מחט הדיודה בצינור הדגימה, ואז משכו אותה במהירות החוצה כדי לגרום להתגבשות הדגימה בטמפרטורה של -6.2 מעלות צלזיוס.
  4. המתן עד שהמסך יוצג: לחץ את הראש למעלה ולחץ על Cal ועל Cal 0 בתורו כדי לכייל. בצע מדידות עם פתרון כיול של 300 mOsm ומדוד את הלחץ האוסמוטי של דגימות HECF כמתואר לעיל.
    הערה: נגבו את ראש המדידה במגבת נייר רכה לאחר כיול או מדידה. דגימות HECF ללא בועות יש לערבב היטב.

5. תחזוקת מערכת המיקרודיאליזה והמכשירים לאחר הדגימה

  1. הוציאו את בדיקת המיקרודיאליזה המוחית מצנתר הבדיקה לאחר סיום הדגימה. טבלו את הגשושית במים שעברו דה-יוניזציה ושטפו במים שעברו דה-יוניזציה למשך 12 שעות כדי להסיר שקיעי מלח תקועים מהצינור ומהבדיקה.
  2. הסר את הבדיקה כדי למקם לתוך תמיסת טריפסין 0.05% ב 4 ° C. יבשו את הצינורות בתנור יבש באוויר ב-25°C ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר.
    הערה: בדיקות המיקרודיאליזה יקרות ושלב זה יכול להגדיל את השימוש החוזר של הבדיקות. חלבונים הנצמדים לפני השטח של הגשושית יכולים להיות מעוכלים על ידי תמיסת טריפסין כדי למנוע מממברנת הגשושית להיחסם על ידי חלבונים, ולטריפסין לא הייתה השפעה על חומר הבדיקה.

6. טיפול בבעלי חיים לאחר הדגימה

  1. לאחר הדגימה, הרדימו את החולדות ללא כאב על ידי כך שגרמו להן לשאוף 1.5% איזופלורן, ולאחר מכן מנת יתר של 5% איזופלורן בהתאם לאתיקה של בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות פרוטוקול הניסוי לעיל ופרמטרי הדגימה שנקבעו בטבלה 1, התקבל HECF חולדה דמוי מים, חסרת צבע ושקופה בקצב הדגימה שנקבע (איור 1K). הלחץ האוסמוטי של החולדה המתקבלת HECF היה 290-310 mOsm/L, אשר יכול להבטיח בעקיפין את איכות הדגימות18,19.

Figure 1
איור 1: HECF של חולדות שנאסף באמצעות ציוד הדגימה של מיקרודיאליזה . (A,B) מערכת ההרדמה של בעלי חיים ומערכת סטריאוטקסית דיגיטלית שימשו להרדים ולשתק חולדות. (ג) צינור איסוף דגימה למערכת מיקרודיאליזה. (D) המבנה האנטומי הגולגולתי של החולדה הראה בבירור את התפר ברגמה ולמבדואידל. (E) צנתר סטילט ובדיקת מיקרודיאליזה מוחית, המציגים את קרום הדיאליזה ופיר הפלדה של הבדיקה. (F) המתקן הקבוע במבחנה של בדיקת המיקרודיאליזה יושם לאחסון וניקוי בדיקות. (ז) ארבעה מזרקים נוזליים של משאבת המזרק. (ח, ט) מסתובב נירוסטה ובקר מסתובב רב ערוצי במערכת לבעלי חיים הנעים בחופשיות. (J) אספן שברים מקורר דו-ערוצי. (K) התקבל HECF חולדה על ידי מיקרודיאליזה. (L) מיכל תנועה חופשית לחולדות. (יג) רכיבים קשורים של מערכת דגימת המיקרודיאליזה -. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמה סכמטית של גשושית מיקרודיאליזה במוח המשובצת באזור ההיפוקמפוס במוח של חולדה. שלושה פתחים יוצרים משולש, ופתח הגשושית נמצא במיקום מרכזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פריטי פרמטרים ערך
קצב זילוח 1 μL/דקה
קצב הדגימה 1 μL/דקה
טמפרטורת הדגימה 4 °C

טבלה 1: הגדרת פרמטרים עבור מערכת דגימת נוזל מוחי שדרתי של מיקרודיאליזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפתוגנזה של מחלות CNS עדיין לא מובנת במלואה, מה שמעכב את הפיתוח של טיפולים ותרופות חדשות. מחקרים הראו כי רוב מחלות CNS קשורות קשר הדוק נגעים בהיפוקמפוס20,21,22. טכניקת המיקרודיאליזה המוצעת במוח יכולה להתמקד באזורים ספציפיים במוח, במיוחד בהיפוקמפוס, מה שהופך אותה לבולטת מהגישה המסורתית של איסוף HECF. בדיקות ממוקמות באזור CA1 במוח החולדה באמצעות ניתוח השתלה כדי להפריד מולקולות בגודל מסוים על ידי דיפוזיה פסיבית של קרום מלאכותי. השתלת הגשושית היא שלב מכריע שבו כל נזק לגשושית וכל נזק מקומי של רקמת המוח, כגון חלבון, צבר23, שעלול היה להיגרם כתוצאה מהשתלת הגשושית, יוביל לכישלון הניסוי או לעלייה באי הדיוק של המדידה. לכן, חיוני לבדוק את שלמות הבדיקה ולתת לבעל החיים תקופת החלמה נאותה לאחר ניתוח השתלת בדיקת מיקרודיאליזה.

בשנים האחרונות, השימוש באתנו-רפואה לטיפול במחלות מוח גדל24,25. השיטה המסורתית להשגת נוזל מוחי ונוזל אינטרסטיציאלי במוח היא לרוב אירוע חד פעמי עם הסתברות גבוהה לזיהום דם 8,9. והכי חשוב, אי אפשר לראות את השינויים הדינמיים של תרופות ואת המטבוליטים שלהם בגוף. כטכניקת דגימה מקוונת לאורגניזמים ערים, למיקרודיאליזה במוח יש מאפיינים של להיות in vivo, זעיר פולשני, גודל מדגם קטן, בזמן אמת ודינמי, מה שמפצה על הפגמים של שיטות הדגימה המסורתיות26. בשילוב עם טכנולוגיית ניתוח וזיהוי מודרנית, ניתוח איכותי וכמותי של גורמי מחלה ומרכיבי תרופות יכול להתבצע בצורה מדויקת יותר27. באופן כללי, יש משמעות רבה להציג מיקרודיאליזה במוח לחקר מחלות מוח ולחשוף את מנגנון הפעולה של אתנורפואה.

טכניקת דגימת מיקרודיאליזה חוץ גופית של HECF יכולה להיות מיושמת למניעה וטיפול במחלות CNS על ידי תרופות. פגיעות מוחיות משניות הכוללות שינויים בהרכבי HECF הן הגורם העיקרי לתמותה מוגברת של פגיעה מוחית איסכמית, היפוקסית ופגיעה מוחית טראומטית. בתגובה, ניתוח של HECF המבוסס על טכנולוגיית מיקרודיאליזה במוח יכול לאבחן באופן דינמי סמנים ביולוגיים מוקדמים של מחלות CNS אלה כדי להפחית תחלואה ותמותה, כמו גם לשפר את פרוגנוזה28,29. לאחר הטיפול, ריכוז התרופות ברקמת המוח נקבע באופן שגרתי על ידי מדידת רקמת מוח שלמה הומוגנית במהלך מחקרים פרה-קליניים, אך לא ניתן לבצע תצפית ישירה על ריכוז באזורי המוח הספציפיים. כדי להתגבר על כך, ריכוזי תרופות וסמנים פתולוגיים באזורים מסוימים במוח יכולים להיות מנותחים כמותית בשילוב עם טכניקות דגימה מיקרודיאליזה במוח30. במיוחד עבור צמחי מרפא אתניים מרובי רכיבים, ניתוח כימי המבוסס על דגימת מיקרודיאליזה במוח יכול להתמקד ולחשוף את התעלומה של הרכב-אזור המוח - מנגנונים בטיפול במחלות CNS31,32. בנוסף, שינויים בצבע, בשקיפות ובלחץ האוסמוטי של החולדה HECF עשויים להתרחש במצבי מחלה שונים, כגון דימום מוחי, גידולים במוח ודלקת קרום המוח. באמצעות HPLC או ספקטרומטריית מסות, חוקרים יכולים לקבוע את השינויים בהרכב HECF באנצפלופתיות שונות.

באופן כללי, טכנולוגיית דגימת מיקרודיאליזה במוח יכולה להקל על חקירת המנגנון הפתולוגי של מחלות CNS ופיתוח תרופות חדשות. עם זאת, אילוצים נוספים שיש להתגבר עליהם ליישום יעיל של המערכת כוללים את הנזק לרקמה שמסביב לאחר החדרת בדיקת המיקרודיאליזה באזור המטרה של המוח, האפשרות של הרס BBB, והעברת מסה מוגבלת על פני הממברנה 14,33,34. לסיכום, לטכנולוגיית מיקרודיאליזה במוח יש סיכויי יישום רחבים בחקר הפתוגנזה של מערכת העצבים המרכזית ופיתוח תרופות חדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82104533), מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2021YJ0175), והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M683273). המחברים רוצים להודות למר יונצ'נג הונג, מהנדס ציוד בכיר בחברת Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (סינגפור) למתן שירותים טכניים לטכניקת המיקרודיאליזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Air-drying oven Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd GHG-9240A
Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Artificial cerebrospinal fluid Beijing leagene biotech. Co., Ltd CZ0522
Brain microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T56518
Catheter  CMA Microdialysis AB T56518
Covance infusion harness Instech Laboratories, Inc. CIH95
Denture base resins Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd 190732
Electric cranial drill Rayward Life Technology Co., Ltd 78001
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd H51021208
Iodophor Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd 202201
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Microdialysis catheter stylet  CMA Microdialysis AB 8011205
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Osmometer Löser OM 807
Sodium hyaluronate eye drops URSAPHARM Arzneimittel GmbH H20150150
Stereotaxie apparatus Rayward Life Technology Co., Ltd 68025
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T56518
Trypsin solution Boster
Biological Technology, Ltd.		 PYG0107
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
  2. Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
  3. Kurtzman, R. A. em3, Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
  4. Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin'yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin'yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
  5. Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
  6. Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
  7. Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
  8. Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
  9. Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
  10. Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
  11. Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
  12. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 7, Unit 7.1 (2009).
  13. Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
  14. Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
  15. Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
  16. Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer's disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
  17. Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
  18. Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
  19. Wang, X. B. Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , Ningxia Medical University. Master's thesis (2017).
  20. Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
  21. Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
  22. Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
  23. Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
  24. Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
  25. Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
  26. König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
  27. Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
  28. de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
  29. Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
  30. Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
  31. Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
  32. Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
  33. Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
  34. Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 188
איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng,… More

Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng, X., Hou, Y., Zhang, S. Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System. J. Vis. Exp. (188), e64530, doi:10.3791/64530 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter