Summary
여기서 프로토콜은 미세 투석 시스템을 사용하여 깨어 있는 쥐의 해마에서 세포외액의 상세한 실시간 동적 샘플링을 제공합니다.
Abstract
다양한 중추신경계(CNS) 질환은 해마 세포외액(HECF) 구성의 변화와 관련이 있습니다. 그러나 의식이 있는 쥐로부터 실시간으로 HECF를 얻는 데 어려움이 있어 CNS 질병 진행 평가와 민족의학 요법의 효과가 오랫동안 제한되어 왔습니다. 고무적으로, 뇌 미세 투석 기술은 동적 관찰, 정량 분석 및 작은 샘플링 크기의 장점으로 연속 샘플링에 사용될 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 동물의 뇌에서 전통적인 허브의 화합물과 대사 산물에 대한 세포 외액 함량의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목적은 3차원 뇌 정위 장치를 사용하여 Sprague Dawley(SD) 쥐의 해마 영역에 뇌척수액 미세 투석 프로브를 정확하게 이식하여 20kDa 이상의 분자량을 차단하는 것이었습니다. 그런 다음 2.87nL/min - 2.98mL/min에서 샘플링 속도를 조정할 수 있는 미세 투석 샘플링 제어 시스템을 사용하여 의식이 있는 쥐로부터 고품질 HECF를 얻었습니다. 결론적으로, 우리의 프로토콜은 미세 투석 기술의 도움으로 깨어 있는 쥐에서 HECF를 얻을 수 있는 효율적이고 신속하며 역동적인 방법을 제공하여 CNS 관련 질병의 발병기전을 추가로 탐색하고 약물 효능을 평가할 수 있는 무한한 가능성을 제공합니다.
Introduction
신경퇴행성 질환, 외상성 뇌 손상, 고지대 저산소증으로 인한 뇌 손상 및 허혈성 뇌졸중과 같이 이환율이 높은 중추신경계(CNS) 질환은 전 세계적으로 사망률이 증가하는 중요한 원인입니다 1,2,3. 특정 뇌 영역의 사이토카인 및 단백질 변화의 실시간 모니터링은 중추신경계 질환의 진단 정확도와 투약 후 뇌 약동학 연구에 기여합니다. 전통적인 과학 연구는 특정 물질의 검출 및 약동학 연구를 위해 뇌 조직 균질액 또는 동물 간질 뇌액의 수동 수집을 사용합니다. 그러나 이것은 제한된 표본 크기, 지표의 변화를 동적으로 관찰할 수 없음, 고르지 않은 표본 추출 품질 4,5,6과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 간질액인 뇌척수액은 뇌와 척수를 기계적 손상으로부터 보호합니다. 그 구성은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재로 인해 혈청의 구성과 다릅니다.7. 뇌척수액 샘플의 직접 분석은 CNS 병변 및 약물 발견의 메커니즘을 밝히는 데 더 도움이 됩니다. 필연적으로, 주사기를 통해 수조 마그나 및 뇌실에서 직접 수동으로 얻은 뇌척수액 샘플은 혈액 오염의 단점, 무작위 샘플 수집 기회, 수량의 불확실성 및 다중 검색 가능성이 거의 없습니다 8,9. 특히, 기존의 간질성 뇌액 샘플링 방법은 손상된 뇌 영역에서 샘플을 얻을 수 없어 특정 뇌 영역에서 CNS 질환의 발병기전을 탐색하고 표적 민족 의학 요법의 효능 평가를 방해합니다 9,10.
뇌 미세투석(brain microdialysis)은 깨어 있는 동물에서 간질성 뇌액을 채취하는 기술이다11. 미세 투석 시스템은 뇌에 이식 된 프로브의 도움으로 혈관 투과성을 모방합니다. 미세 투석 프로브는 반투과성 막으로 무장하고 특정 뇌 영역에 이식됩니다. 등장성 인공 뇌척수액(African artificial cerebrospinal fluid, ACSF)으로 관류한 후, 투석된 간질성 뇌액은 작은 표본 크기, 연속적인 샘플링 및 동적 관찰의 이점으로 유리하게 수집될 수 있다12,13. 위치 측면에서, 뇌 미세투석 프로브는 관심 있는 뇌 구조 또는 두개골 수조에 선택적으로 이식될 수 있다14. 해마 세포 외액 (HECF)에서 내인성 물질의 비정상적인 수준을 관찰하면 CNS 질환의 발생 또는 질병의 발병 기전을 알 수 있습니다. 여러 연구에 따르면 정신분열증의 D-아미노산, 알츠하이머병의 β-아밀로이드 및 타우 단백질, 외상성 뇌 손상의 신경필라멘트 경쇄, 저산소성 허혈성 뇌병증의 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 L1과 같은 CNS 질환에 대한 바이오마커를 뇌척수액에서 분석할 수 있습니다15,16,17 . 뇌 미세투석 샘플링 기법에 기초한 화학 분석 방법을 사용하여 특정 뇌 영역에서 확산 및 분포하는 민족 의학의 활성 성분과 같은 외인성 화합물의 동적 변화를 모니터링할 수 있다14.
이 기사는 깨어 있는 쥐에서 동적 HECF 획득의 특정 과정을 제시하고 샘플 품질을 보장하기 위해 삼투압을 측정합니다.
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Protocol
실험 프로토콜은 청두 한의과대학 실험동물 사용 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(기록 번호: 2021-11)의 요구 사항에 따라 수행되었습니다. 수컷 Sprague Dawley (SD) 래트(280 ± 20 g, 6-8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 뇌 미세 투석 프로브 이식 수술
- 쥐 마취의 유도 및 유지를 위해 각각 3% 및 1.5% 이소플루란을 사용하고 0.6L/min의 공기-산소 혼합물에서 동물 마취 시스템을 사용합니다. 쥐가 통증 반사와 각막 반사 없이 깊게 마취되었는지 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용하십시오.
- 준비 구역에서 전기 면도기로 마취 된 쥐의 두개골에 있는 털을 제거합니다. 그런 다음 마취 된 쥐를 정위 뇌 탐지기에 고정시킵니다. 수술 전 수술 부위에 포비돈 요오드와 에탄올 3배를 멸균 면봉으로 발라 수술 부위를 소독합니다. 국소 진통을 위해 부피바카인을 국소적으로 바르십시오. 참고: 미세 투석 기반 HECF 샘플 수집의 전체 프로세스는 그림 1에 나와 있습니다.
- 수술용 가위로 중간에 1.5cm 두개안면 절개를 하고 수술용 가위와 안과용 집게를 사용하여 골막을 제거합니다.
- 브레그마를 기저 위치로 간주하고 두개골을 뚫어 전후(AP) 위치(-2mm), 내측(ML) 위치(-3.5mm) 및 배측(DV) 위치(-3.5mm)(해마 CA1 영역)에서 2mm 구멍을 뚫습니다.
- 정위 뇌 탐지기의 그리퍼에 카테터 스타일릿을 고정하고 AP(-2mm), ML(-3.5mm) 및 DV(0mm) 위치에서 미세 투석 케이싱의 위치를 조정합니다. 뇌 스테레오 로케이터의 DV 값을 조정하고 미세 투석 케이싱을 3.5mm 깊이의 CA1 영역에 이식합니다.
알림: 동물 온도 유지 장치를 사용하여 작동 중 동물의 온도를 37°C로 유지하십시오. - 3개의 구멍이 프로브 구멍이 중앙에 위치하는 삼각형을 형성하도록 직경 2mm의 구멍 3개를 더 뚫습니다. 1mm 깊이의 구멍에 나사를 삽입합니다.
- 프로브 카테터를 치과용 시멘트로 고정하고 4-0 수술용 봉합사를 사용하여 피부를 봉합합니다. 프로브 배치는 그림 2 를 참조하십시오.
- 회복을 위해 7 일 동안 새장에 쥐를 두십시오. 수술 후 1일 1회 부피바카인(1.5mg/kg)을 국소적으로 침윤시킵니다. 음식과 물을 임의로 제공하십시오. 히알루론산 나트륨 점안액을 하루에 3번 사용하여 수술 후 건조를 예방하십시오.
알림: 모든 절차는 멸균 수술실에서 수행하십시오. 동물이 37 °C 조건에서 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 수술을받은 동물을 다른 동물의 회사에 돌려 보내지 마십시오.
2. 미세 투석 시스템 연결 및 프로브 점검
- 미세 투석 펌프, 미세 주사기, 각성 활동 장치 및 극저온 s를 연결하십시오.amp제조업체의 지침에 따라 수집기. 미세 투석 펌프에 ACSF가 있는 미세 주사기를 설치하고 미세 투석 펌프를 1μL/min의 속도로 설정하여 파이프라인의 공기를 배출합니다.
- 파이프라인과 뇌 미세 투석 프로브를 연결합니다(멤브레인: PAES, 멤브레인 길이: 4mm, 멤브레인 OD: 0.5mm, 컷오프: 20kDa, 샤프트 길이: 14mm). 미세 투석 펌프를 1μL/min의 속도로 작동하여 프로브 표면이 약간 촉촉해질 때까지 ACSF를 프로브에 주입합니다. 후속 사용을 위해 프로브를 헤파린 나트륨 주입 용액에 담그십시오.
알림: 중력 상태에서 육안으로 볼 수 있듯이 ACSF의 큰 흐름이 프로브의 반투과성 멤브레인에서 떨어지면 프로브를 새 것으로 교체하십시오.
3. 깨어있는 쥐의 HECF 수집
- 뇌 미세 투석 프로브를 프로브 카테터에 삽입하고 쥐가 자유롭게 움직일 수 있도록 패딩이 있는 챔버(높이: 360mm, 직경: 400mm)에 쥐를 넣습니다.
- 파이프라인, 미세주사기 펌프 및 뇌 미세투석 프로브를 연결합니다. 쥐 구속 장치 상단의 구멍과 스테인리스 스틸 스위블을 통해 쥐를 연결합니다.
- 쥐가 자유롭게 움직이는 동안 미세 투석 파이프 라인이 얽히지 않도록 다중 채널 회전 컨트롤러를 켭니다. 미세 주사기 펌프를 켜고 ACSF를 1μL/min의 속도로 펌핑합니다. 미세투석 HECF 수집 시스템의 60분 평형 후 주기적으로 HECF를 수집합니다.
- HECF의 유속이 있는지 확인하십시오.amp냉장 분획 수집기의 파일은 ACSF 주입과 일치합니다. 20μL의 HECF를 수집하고 다음 샘플링 튜브로 자동 변경합니다. 프로브를 삽입할 때 프로브 멤브레인이 손상되지 않았는지 주의하십시오.
4. HECF에 대한 삼투압 측정
- 삼투압계를 켜고 감지 시스템에 로그인합니다. 터치 스크린에서 Cal 버튼을 클릭하고 페이지에서 Res 버튼을 클릭하여 이전 보정 메모리를 지웁니다.
- 기포가 없는 순수한 물 100μL가 들어 있는 1.5mL 튜브를 측정 헤드에 설치합니다. 측정 헤드를 차가운 히드라진 용기의 바닥으로 당깁니다.
- 터치 스크린에 샘플 번호 0을 입력하고 테스트를 확인합니다. 다이오드 바늘을 샘플 튜브에 빠르게 담근 다음 빠르게 당겨 -6.2 °C의 온도에서 샘플의 결정화를 유도합니다.
- 화면이 표시될 때까지 기다립니다: 측정 헤드를 위로 밀고 Cal 및 Cal 0을 차례로 클릭하여 보정합니다. 300mOsm 보정 용액으로 측정을 수행하고 위에서 설명한 대로 HECF 샘플의 삼투압을 측정합니다.
알림: 보정 또는 측정 후에는 부드러운 종이 타월로 측정 헤드를 닦으십시오. 기포가 없는 HECF 샘플은 잘 혼합되어야 합니다.
5. 샘플링 후 미세 투석 시스템 및 장치의 유지 보수
- 샘플링 종료 후 프로브 카테터에서 뇌 미세 투석 프로브를 꺼냅니다. 프로브를 탈이온수에 담그고 탈이온수로 12시간 동안 세척하여 파이프라인과 프로브에서 좌초된 염 침전물을 제거합니다.
- 프로브를 제거하고 4°C에서 0.05% 트립신 용액을 넣는다. 파이프라인을 25°C의 공기 건조 오븐에서 건조하고 실온에서 보관하십시오.
참고: 미세 투석 프로브는 비싸고 이 단계는 프로브의 재사용성을 높일 수 있습니다. 프로브 표면에 부착된 단백질은 트립신 용액으로 분해되어 프로브 막이 단백질에 의해 차단되는 것을 방지할 수 있으며 트립신은 프로브 물질에 영향을 미치지 않았습니다.
6. 시료 채취 후 동물 처리
- 샘플링 후, 동물 윤리에 따라 1.5% 이소플루란을 흡입하게 한 다음 5% 이소플루란을 과다 투여하여 고통 없이 안락사시킵니다.
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Representative Results
상기 실험 프로토콜 및 표 1에 설정된 샘플링 파라미터에 따라, 설정된 샘플링 속도에서 물-유사, 무색 및 투명 래트 HECF를 수득하였다(도 1K). 수득 된 쥐 HECF의 삼투압은 290-310 mOsm / L이며, 이는 간접적으로 샘플18,19의 품질을 보장 할 수있다.
그림 1: 미세 투석 샘플링 장비를 사용하여 수집된 쥐 HECF. (A,B) 동물 마취 시스템과 디지털 디스플레이 정위 장치를 사용하여 쥐를 마취시키고 고정시켰습니다. (C) 미세 투석 시스템용 샘플링 수집 튜브. (D) 쥐의 두개골 해부학적 구조는 브레그마와 람도이드 봉합사를 명확하게 보여주었습니다. (e) 탐침 카테터와 뇌 미세투석 프로브, 투석막 및 프로브의 강철 축을 전시하는 것. (F) 미세 투석 프로브의 시험관 내 고정 가대를 적용하여 프로브를 저장하고 세척했습니다. (g) 4개의 주사기 펌프의 주사기 액체 전달. (H, 나) 스테인리스 스틸 스위블 및 다채널 스위블 컨트롤러는 동물을 자유롭게 움직일 수 있도록 시스템에 있습니다. (J) 2채널 냉장 분획 분취기. (k) 미세투석에 의해 쥐 HECF를 수득하였다. (L) 쥐를 위한 자유로운 움직임 탱크. (m) 미세 투석 샘플링 시스템의 관련 구성 요소-. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쥐 뇌의 해마 영역에 내장된 뇌 미세투석 프로브의 개략도. 3개의 구멍이 삼각형을 형성하고 프로브 오리피스는 중앙에 위치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 항목 | 값 |
| 관류율 | 1 μL/분 |
| 샘플링 속도 | 1 μL/분 |
| 샘플링 온도 | 섭씨 4도 |
표 1: 미세 투석 뇌척수액 샘플링 시스템에 대한 매개변수를 설정합니다.
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Discussion
중추 신경계 질환의 발병 기전은 아직 완전히 이해되지 않아 새로운 치료법과 약물 개발을 방해합니다. 연구에 따르면 대부분의 CNS 질환은 해마 병변과 밀접한 관련이 있습니다20,21,22. 제안 된 뇌 미세 투석 기술은 뇌의 특정 영역, 특히 해마를 표적으로 삼을 수 있으므로 HECF를 수집하는 전통적인 접근 방식에서 두드러집니다. 이식 수술을 통해 쥐 뇌의 CA1 영역에 프로브를 배치하여 인공막의 수동 확산에 의해 특정 크기의 분자를 분리합니다. 프로브의 이식은 프로브의 손상 및 프로브 이식으로 인해 발생할 수 있는 단백질, 응집체(23)와 같은 뇌 조직의 국소 손상이 실험의 실패 또는 측정의 부정확성의 증가로 이어질 수 있는 중요한 단계입니다. 따라서 프로브의 무결성을 확인하고 미세투석 프로브 이식 수술 후 동물에게 적절한 회복 기간을 부여하는 것이 필수적입니다.
최근 몇 년 동안 뇌 질환을 치료하기위한 민족 의학의 사용이24,25 증가하고 있습니다. 뇌에서 뇌척수액과 간질액을 얻는 전통적인 방법은 대부분 혈액 오염 가능성이 높은 일회성 사건입니다 8,9. 가장 중요한 것은 신체에서 약물과 대사 산물의 역동적 인 변화를 관찰하는 것이 불가능하다는 것입니다. 깨어 있는 유기체에 대한 온라인 샘플링 기술로서, 뇌 미세투석은 생체 내(in vivo), 최소 침습적, 작은 샘플 크기, 실시간, 동적 특성을 가지고 있으며, 이는 전통적인 샘플링 방법(26)의 결함을 보완한다. 최신 분석 및 검출 기술과 결합하여 질병 요인 및 약물 성분에 대한 정성 및 정량 분석을 보다 정확하게 수행할 수 있습니다27. 일반적으로 뇌 질환 연구를 위해 뇌 미세 투석을 도입하고 민족 의학의 작용 메커니즘을 밝히는 것이 매우 중요합니다.
HECF의 체외 미세투석 샘플링 기술은 약물에 의한 CNS 질환의 예방 및 치료에 적용될 수 있다. HECF 조성물의 변화를 수반하는 이차성 뇌 손상은 허혈성 저산소성 뇌 손상 및 외상성 뇌 손상의 사망률 증가의 주요 원인입니다. 이에 대응하여 뇌 미세 투석 기술을 기반으로 한 HECF 분석은 이러한 CNS 질환의 초기 바이오마커를 동적으로 진단하여 이환율과 사망률을 줄이고 예후를 개선할 수 있습니다28,29. 치료 후 뇌 조직의 약물 농도는 전임상 연구에서 균질화된 전체 뇌 조직을 측정하여 일상적으로 결정되지만 특정 뇌 영역의 농도를 직접 관찰하는 것은 수행할 수 없습니다. 이를 극복하기 위해, 특정 뇌 영역에서의 약물 농도 및 병리학적 마커는 뇌 미세투석 샘플링 기술(30)과 조합하여 정량적으로 분석될 수 있다. 특히 다성분 민족 허브의 경우 뇌 미세 투석 샘플링을 기반으로 한 화학 분석은 CNS 질병 치료에서 구성-뇌 영역-메커니즘의 미스터리에 초점을 맞추고 밝힐 수 있습니다31,32. 또한, 래트 HECF의 색, 투명도 및 삼투압의 변화는 뇌출혈, 뇌종양 및 수막염과 같은 상이한 질병 상태에서 발생할 수 있다. HPLC 또는 질량 분석법을 사용하여 연구자들은 다양한 뇌병증에서 HECF 조성의 변화를 결정할 수 있습니다.
일반적으로 뇌 미세 투석 샘플링 기술은 CNS 질환의 병리학 적 메커니즘 조사 및 신약 개발을 용이하게 할 수 있습니다. 그러나, 시스템의 효과적인 적용을 위해 극복될 필요가 있는 추가의 제약은 뇌의 표적 영역에 미세투석 프로브의 삽입 후 주변 조직에 대한 손상, BBB 파괴의 가능성, 및 막을 가로지르는 제한된 질량 전달을 포함한다14,33,34. 결론적으로, 뇌 미세 투석 기술은 CNS 발병 기전 탐색 및 신약 개발에 광범위한 응용 전망을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82104533), 쓰촨성 과학 기술부 (2021YJ0175) 및 중국 박사후 과학 재단 (2020M683273)의 지원을 받았습니다. 저자는 Tri-Angels D&H Trading Pte.의 선임 장비 엔지니어인 Mr. Yuncheng Hong에게 감사의 말을 전합니다. Ltd. (싱가포르)는 미세 투석 기술에 대한 기술 서비스를 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
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