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Neuroscience

माइक्रोडायलिसिस सिस्टम का उपयोग करके सचेत चूहों से हिप्पोकैम्पल एक्स्ट्रासेल्युलर तरल पदार्थ का वास्तविक समय गतिशील संग्रह

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64530
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,3, 3, 1,2
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

यहां प्रोटोकॉल एक माइक्रोडायलिसिस सिस्टम का उपयोग करके जागृत चूहों के हिप्पोकैम्पस से बाह्य तरल पदार्थ का एक विस्तृत वास्तविक समय गतिशील नमूना प्रदान करता है।

Abstract

विभिन्न प्रकार के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोग हिप्पोकैम्पल बाह्य तरल पदार्थ (एचईसीएफ) की संरचना में परिवर्तन से जुड़े हैं। हालांकि, जागरूक चूहों से वास्तविक समय में एचईसीएफ प्राप्त करने में कठिनाई ने लंबे समय तक सीएनएस रोग की प्रगति और नृवंशविज्ञान चिकित्सा की प्रभावशीलता के मूल्यांकन को प्रतिबंधित कर दिया है। उत्साहजनक रूप से, गतिशील अवलोकन, मात्रात्मक विश्लेषण और एक छोटे नमूने के आकार के फायदे के साथ निरंतर नमूनाकरण के लिए एक मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। यह पारंपरिक जड़ी बूटियों और जीवित जानवरों के मस्तिष्क में उनके मेटाबोलाइट्स से यौगिकों के लिए बाह्य तरल पदार्थ सामग्री में परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है। इस अध्ययन का उद्देश्य इस प्रकार एक त्रि-आयामी मस्तिष्क स्टीरियोटैक्सिक तंत्र के साथ स्प्राग डॉवले (एसडी) चूहों के हिप्पोकैम्पल क्षेत्र में एक मस्तिष्कमेरु द्रव माइक्रोडायलिसिस जांच को सटीक रूप से प्रत्यारोपित करना था, जो 20 केडीए से अधिक आणविक भार को काटता है। उच्च गुणवत्ता वाले एचईसीएफ को तब 2.87 एनएल / मिनट - 2.98 एमएल / मिनट से समायोज्य नमूना दर के साथ माइक्रोडायलिसिस नमूना नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करके जागरूक चूहों से प्राप्त किया गया था। अंत में, हमारा प्रोटोकॉल माइक्रोडायलिसिस तकनीक की मदद से जागृत चूहों में एचईसीएफ प्राप्त करने के लिए एक कुशल, तेजी से और गतिशील विधि प्रदान करता है, जो हमें सीएनएस से संबंधित बीमारियों के रोगजनन का पता लगाने और दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए असीमित संभावनाएं प्रदान करता है।

Introduction

उच्च रुग्णता वाले केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोग, जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, उच्च ऊंचाई हाइपोक्सिया-प्रेरित मस्तिष्क की चोट, और इस्केमिक स्ट्रोक, दुनिया भर में बढ़ती मृत्यु दर के महत्वपूर्ण कारण हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में साइटोकिन्स और प्रोटीन परिवर्तनों की वास्तविक समय की निगरानी दवा के बाद सीएनएस रोगों और मस्तिष्क फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों की नैदानिक सटीकता में योगदान देती है। पारंपरिक वैज्ञानिक अनुसंधान विशिष्ट पदार्थों का पता लगाने और फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन के लिए मस्तिष्क ऊतक होमोजेनेट या पशु अंतरालीय मस्तिष्क द्रव के मैनुअल संग्रह का उपयोग करता है। हालांकि, इसमें कुछ कमियां हैं, जैसे कि सीमित नमूना आकार, संकेतकों के परिवर्तनों को गतिशील रूप से देखने में असमर्थता, और असमान नमूना गुणवत्ता 4,5,6। मस्तिष्कमेरु द्रव, एक अंतरालीय तरल पदार्थ, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को यांत्रिक क्षति से बचाता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) 7 के अस्तित्व के कारण इसकी संरचना सीरम से अलग है। मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूनों का प्रत्यक्ष विश्लेषण सीएनएस घावों और दवा की खोज के तंत्र का खुलासा करने के लिए अधिक अनुकूल है। अनिवार्य रूप से, मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूने, जो मैन्युअल रूप से सिस्टर्ना मैग्ना और सेरेब्रल वेंट्रिकल्स से सिरिंज के माध्यम से सीधे प्राप्त किए जाते हैं, में रक्त संदूषण के नुकसान, नमूना संग्रह का एक यादृच्छिक मौका, मात्रा की अनिश्चितता, और लगभग कोई एकाधिक पुनर्प्राप्ति संभावनानहीं है। अधिक विशेष रूप से, पारंपरिक अंतरालीय मस्तिष्क द्रव नमूनाकरण विधियां क्षतिग्रस्त मस्तिष्क क्षेत्रों से नमूने प्राप्त नहीं कर सकती हैं, जो विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में सीएनएस रोगों के रोगजनन की खोज और लक्षित नृवंशविज्ञानउपचारों की प्रभावकारिता मूल्यांकन में बाधा डालती हैं।

मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिसजागृत जानवरों में अंतरालीय मस्तिष्क द्रव के नमूने के लिए एक तकनीक है। माइक्रोडायलिसिस प्रणाली मस्तिष्क में प्रत्यारोपित एक जांच की मदद से संवहनी पारगम्यता की नकल करती है। माइक्रोडायलिसिस जांच एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली से लैस है और इसे विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जाता है। आइसोटोनिक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) के साथ छिड़काव के बाद, डायलाइज्ड इंटरस्टीशियल मस्तिष्क द्रव को छोटे नमूना आकार, निरंतर नमूनाकरण और गतिशील अवलोकन12,13 के लाभों के साथ अनुकूल रूप से एकत्र किया जा सकता है। स्थान के संदर्भ में, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच को चुनिंदा रूप से मस्तिष्क संरचनाओं या कपाल कुंडों में प्रत्यारोपित किया जा सकताहै। हिप्पोकैम्पल बाह्य तरल पदार्थ (एचईसीएफ) में एक अंतर्जात पदार्थ के असामान्य स्तर का अवलोकन सीएनएस रोगों या रोग के रोगजनन की घटनाओं का सुझाव देता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि सीएनएस रोगों के लिए बायोमार्कर, जैसे कि स्किज़ोफ्रेनिया में डी-एमिनो एसिड, अल्जाइमर रोग में β-एमिलॉयड और ताऊ प्रोटीन, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट में न्यूरोफिलामेंट लाइट चेन, और हाइपोक्सिक इस्केमिया एन्सेफैलोपैथी में यूबिकिटिन कार्बोक्सी-टर्मिनल हाइड्रोलेज़ एल 1 एस, मस्तिष्कमेरु द्रव 15,16,17 में विश्लेषण किया जा सकता है . मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस नमूना तकनीक पर आधारित एक रासायनिक विश्लेषण विधि का उपयोग बहिर्जात यौगिकों के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए किया जा सकता है जैसे कि नृवंशविज्ञान के सक्रिय तत्व, जो विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में फैलते हैं और वितरित होतेहैं।

यह लेख जागृत चूहों में गतिशील एचईसीएफ अधिग्रहण की विशिष्ट प्रक्रिया प्रस्तुत करता है और नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए इसके आसमाटिक दबाव को मापता है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रोटोकॉल चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (रिकॉर्ड संख्या: 2021-11) में प्रयोगशाला जानवरों और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के उपयोग की आवश्यकताओं के अनुसार आयोजित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए नर स्प्राग डॉवले (एसडी) चूहों (280 ± 20 ग्राम, 6-8 सप्ताह पुराने) का उपयोग किया गया था।

1. मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच आरोपण सर्जरी

  1. 0.6 एल / मिनट पर वायु-ऑक्सीजन मिश्रण में पशु संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करके, चूहे के संज्ञाहरण के प्रेरण और रखरखाव के लिए क्रमशः 3% और 1.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि चूहों को दर्द रिफ्लेक्स और कॉर्नियल रिफ्लेक्स दोनों के बिना गहराई से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम का उपयोग करें।
  2. तैयारी क्षेत्र में एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ एनेस्थेटाइज्ड चूहे की खोपड़ी पर फर को हटा दें। फिर, एक स्टीरियोटैक्सिक मस्तिष्क लोकेटर पर एनेस्थेटाइज्ड चूहे को ठीक करें। एक बाँझ कपास की गेंद के साथ सर्जरी के क्षेत्र में पोविडोन-आयोडीन और इथेनॉल 3 एक्स लगाकर ऑपरेशन से पहले सर्जिकल साइट को कीटाणुरहित करें। स्थानीय एनाल्जेसिया के लिए शीर्ष पर बुपिवैकेन लागू करें। नोट: माइक्रोडायलिसिस-आधारित एचईसीएफ नमूना अधिग्रहण की पूरी प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है।
  3. सर्जिकल कैंची के साथ बीच में 1.5 सेमी क्रानियोफेशियल चीरा लगाएं और सर्जिकल कैंची और नेत्र बल का उपयोग करके पेरीओस्टेम को हटा दें।
  4. ब्रेग्मा को बेसल स्थिति के रूप में देखें और कपाल ड्रिल का उपयोग करके एंटेरोपोस्टेरियर (एपी) स्थिति (-2 मिमी), मेडियोलेटरल (एमएल) स्थिति (-3.5 मिमी), और डोर्सोवेंट्रल (डीवी) स्थिति (-3.5 मिमी) (हिप्पोकैम्पल सीए 1 क्षेत्र) पर 2 मिमी एपर्चर ड्रिल करने के लिए एंडोक्रेनियम को छेदें।
  5. स्टीरियोटैक्सिक मस्तिष्क लोकेटर के ग्रिपर पर कैथेटर स्टाइल को ठीक करें और एपी (-2 मिमी), एमएल (-3.5 मिमी), और डीवी (0 मिमी) स्थितियों में माइक्रोडायलिसिस आवरण की स्थिति को समायोजित करें। मस्तिष्क स्टीरियो लोकेटर के डीवी मूल्य को समायोजित करें, और 3.5 मिमी की गहराई पर सीए 1 क्षेत्र में माइक्रोडायलिसिस आवरण प्रत्यारोपित करें।
    नोट: पशु तापमान रखरखावकर्ता का उपयोग करके ऑपरेशन के दौरान जानवर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  6. 2 मिमी व्यास के साथ तीन और एपर्चर ड्रिल करें जैसे कि तीन एपर्चर एक त्रिकोण बनाते हैं जिसमें प्रोब एपर्चर केंद्रीय रूप से स्थित होता है। 1 मिमी की गहराई पर एपर्चर में इम्प्लांट स्क्रू।
  7. डेंटल सीमेंट के साथ प्रोब कैथेटर को ठीक करें और त्वचा को बंद करने के लिए 4-0 सर्जिकल सीवन का उपयोग करें। जांच के प्लेसमेंट के लिए चित्रा 2 देखें।
  8. ठीक होने के लिए चूहे को 7 दिनों के लिए पिंजरों में रखें। सर्जरी के बाद दैनिक एक बार स्थानीय रूप से घुसपैठ बुपिवैकेन (1.5 मिलीग्राम / किग्रा)।  लिबिटम के लिए भोजन और पानी प्रदान करें। ऑपरेशन के बाद सूखापन को रोकने के लिए दिन में 3 गुना सोडियम हायलूरोनेट आई ड्रॉप का उपयोग करें।
    नोट: एक बाँझ सर्जिकल रूम में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें। जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह 37 डिग्री सेल्सियस की स्थिति के तहत उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी को सर्जरी से गुजरने वाले जानवर को वापस न करें।

2. माइक्रोडायलिसिस सिस्टम कनेक्शन और जांच जांच

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोडायलिसिस पंप, माइक्रोसिरिंज, जागृत गतिविधि डिवाइस और क्रायोजेनिक नमूना कलेक्टर को कनेक्ट करें। माइक्रोडायलिसिस पंप पर एसीएसएफ के साथ माइक्रोसिरिंज स्थापित करें और पाइपलाइन में हवा का निर्वहन करने के लिए माइक्रोडायलिसिस पंप को 1 μL / min की दर पर सेट करें।
  2. पाइपलाइन और मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच को कनेक्ट करें (झिल्ली: पीएईएस; झिल्ली की लंबाई: 4 मिमी; झिल्ली ओडी: 0.5 मिमी; कट-ऑफ: 20 केडीए; शाफ्ट लंबाई: 14 मिमी)। जांच में एसीएसएफ इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोडायलिसिस पंप को 1 μL / min की दर से संचालित करें जब तक कि जांच की सतह थोड़ी नम न हो जाए। बाद के उपयोग के लिए हेपरिन सोडियम इंजेक्शन समाधान में जांच को डुबोएं।
    नोट: यदि एसीएसएफ की एक बड़ी धारा जांच की अर्धपारगम्य झिल्ली से गिरती है, जैसा कि गुरुत्वाकर्षण के तहत नग्न आंखों से देखा जाता है, तो जांच को एक नए के साथ बदलें।

3. जागृत चूहे से एचईसीएफ का संग्रह

  1. मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच को जांच कैथेटर में डालें और चूहे को पैडिंग के साथ एक कक्ष (ऊंचाई: 360 मिमी; व्यास: 400 मिमी) में रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चूहे घूमने के लिए स्वतंत्र हैं।
  2. पाइपलाइन, माइक्रोसिरिंज पंप और मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच को कनेक्ट करें। चूहे को संयम उपकरण के शीर्ष पर छेद और स्टेनलेस-स्टील के घुमावदार के माध्यम से उपयोग करें।
  3. चूहे के मुक्त आंदोलन के दौरान माइक्रोडायलिसिस पाइपलाइनों को आपस में जोड़ने से बचने के लिए मल्टी-चैनल स्विवेल नियंत्रक चालू करें। माइक्रोसिरिंज पंप चालू करें और एसीएसएफ को 1 μL / min की दर से पंप करें। माइक्रोडायलिसिस एचईसीएफ संग्रह प्रणाली के 60 मिनट के संतुलन के बाद समय-समय पर एचईसीएफ एकत्र करें।
  4. सुनिश्चित करें कि प्रशीतित अंश कलेक्टर में एचईसीएफ नमूनों की प्रवाह दर एसीएसएफ जलसेक के अनुरूप है। एचईसीएफ के 20 μL एकत्र करें और स्वचालित रूप से अगले नमूना ट्यूब में बदलें। जांच डालते समय यह जांचने के लिए ध्यान रखें कि जांच झिल्ली क्षतिग्रस्त है या नहीं।

4. एचईसीएफ के लिए आसमाटिक दबाव का मापन

  1. ऑस्मोमीटर चालू करें और डिटेक्शन सिस्टम में लॉग इन करें। टच स्क्रीन पर कैल बटन पर क्लिक करें और पिछले अंशांकन मेमोरी को साफ़ करने के लिए पृष्ठ पर रेस बटन पर क्लिक करें।
  2. मापने वाले सिर पर बुलबुले के बिना शुद्ध पानी के 100 μL शुद्ध पानी से युक्त 1.5 एमएल ट्यूब स्थापित करें। मापने वाले सिर को ठंडे हाइड्राज़िन कंटेनर के तल पर खींचें।
  3. टच स्क्रीन पर नमूना संख्या 0 दर्ज करें और परीक्षण करने की पुष्टि करें। जल्दी से डायोड सुई को नमूना ट्यूब में डुबोएं, और फिर -6.2 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर नमूने के क्रिस्टलीकरण को प्रेरित करने के लिए इसे जल्दी से बाहर निकालें।
  4. स्क्रीन प्रदर्शित होने की प्रतीक्षा करें: सिर को ऊपर उठाएं और कैलिब्रेट करने के लिए कैल और कैल 0 पर क्लिक करें। 300 mOsm अंशांकन समाधान के साथ माप करें और ऊपर वर्णित HECF नमूनों के आसमाटिक दबाव को मापें।
    नोट: अंशांकन या माप के बाद एक नरम पेपर तौलिया के साथ मापने वाले सिर को पोंछें। बिना बुलबुले वाले एचईसीएफ नमूनों को अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए।

5. नमूना लेने के बाद माइक्रोडायलिसिस सिस्टम और उपकरणों का रखरखाव

  1. नमूना समाप्ति के बाद जांच कैथेटर से मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच को बाहर निकालें। पाइपलाइन और जांच से फंसे नमक के जमाव को हटाने के लिए प्रोब को विआयनीकृत पानी में डुबोएं और 12 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी के साथ लैवेज करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन समाधान में रखने के लिए जांच को हटा दें। पाइपलाइनों को 25 डिग्री सेल्सियस पर एक एयर-ड्राई ओवन में सुखाएं और उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: माइक्रोडायलिसिस जांच महंगी हैं और यह कदम जांच की पुन: प्रयोज्यता को बढ़ा सकता है। जांच की सतह का पालन करने वाले प्रोटीन को प्रोटीन द्वारा अवरुद्ध होने से रोकने के लिए ट्रिप्सिन समाधान द्वारा पचाया जा सकता है, और ट्रिप्सिन का जांच सामग्री पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

6. नमूना लेने के बाद पशु उपचार

  1. नमूने लेने के बाद, दर्द रहित रूप से चूहों को 1.5% आइसोफ्लुरेन में सांस लेने के लिए इच्छामृत्यु करें, इसके बाद पशु नैतिकता के अनुसार 5% आइसोफ्लुरेन का ओवरडोज लें।

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Representative Results

उपरोक्त प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और तालिका 1 में निर्धारित नमूना मापदंडों के बाद, पानी की तरह, रंगहीन और पारदर्शी चूहा एचईसीएफ को निर्धारित नमूना दर (चित्रा 1 के) पर प्राप्त किया गया था। प्राप्त चूहे एचईसीएफ का आसमाटिक दबाव 290-310 एमओएसएम / एल था, जो अप्रत्यक्ष रूप से नमूने की गुणवत्ता18,19 सुनिश्चित कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1: चूहा एचईसीएफ को माइक्रोडायलिसिस नमूना उपकरण का उपयोग करके एकत्र किया गया था। (ए, बी) पशु संज्ञाहरण प्रणाली और डिजिटल-डिस्प्ले स्टीरियोटैक्सिक तंत्र का उपयोग चूहों को एनेस्थेटाइज और गतिहीन करने के लिए किया गया था। (सी) माइक्रोडायलिसिस सिस्टम के लिए नमूना संग्रह ट्यूब। (डी) चूहे की कपाल शारीरिक संरचना ने ब्रेग्मा और लैम्ब्डोइडल सीवन को स्पष्ट रूप से दिखाया। (ई) कैथेटर स्टाइल और मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच, जो डायलिसिस झिल्ली और जांच के स्टील शाफ्ट का प्रदर्शन करती है। (च) माइक्रोडायलिसिस जांच के इन विट्रो फिक्स्ड ट्रेस्टल को भंडारण और स्वच्छ जांच के लिए लागू किया गया था। (जी) सिरिंज पंप की चार सिरिंज तरल वितरण। (एच, आई) स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों के लिए सिस्टम पर स्टेनलेस-स्टील स्विवल्स और मल्टी-चैनल स्विवेल नियंत्रक। (जे) दो-चैनल प्रशीतित अंश कलेक्टर। (के) माइक्रोडायलिसिस द्वारा चूहा एचईसीएफ प्राप्त किया। (एल) चूहों के लिए नि: शुल्क आंदोलन टैंक। (एम) माइक्रोडायलिसिस नमूना प्रणाली के संबंधित घटक- कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चूहे के मस्तिष्क के हिप्पोकैम्पस क्षेत्र में एम्बेडेड मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस जांच का योजनाबद्ध आरेख। तीन एपर्चर एक त्रिकोण बनाते हैं, और जांच छिद्र केंद्रीय रूप से स्थित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पैरामीटर आइटम मूल्य
छिड़काव दर 1 μL/min
नमूनाकरण दर 1 μL/min
नमूना तापमान 4 °C

तालिका 1: माइक्रोडायलिसिस मस्तिष्कमेरु द्रव नमूनाकरण प्रणाली के लिए पैरामीटर सेट करें।

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Discussion

सीएनएस रोगों के रोगजनन को अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है, जो नए उपचारों और दवाओं के विकास में बाधा डालता है। अध्ययनों से पता चला है कि अधिकांश सीएनएस रोग हिप्पोकैम्पल घावों20,21,22 से निकटता से संबंधित हैं। प्रस्तावित मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस तकनीक मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों, विशेष रूप से हिप्पोकैम्पस को लक्षित कर सकती है, जो इसे एचईसीएफ एकत्र करने के पारंपरिक दृष्टिकोण से अलग बनाती है। कृत्रिम झिल्ली के निष्क्रिय प्रसार द्वारा विशिष्ट आकार के अणुओं को अलग करने के लिए प्रत्यारोपण सर्जरी के माध्यम से चूहे के मस्तिष्क के सीए 1 क्षेत्र में जांच रखी जाती है। जांच का आरोपण एक महत्वपूर्ण कदम है जहां जांच को कोई भी नुकसान और मस्तिष्क के ऊतकों की कोई भी स्थानीय क्षति, जैसे प्रोटीन, समुच्चय23, जो जांच आरोपण के कारण हो सकता है, प्रयोग की विफलता या माप की अशुद्धता में वृद्धि का कारण बन सकता है। इसलिए, जांच की अखंडता की जांच करना और माइक्रोडायलिसिस जांच प्रत्यारोपण सर्जरी के बाद जानवर को उचित वसूली अवधि देना आवश्यक है।

हाल के वर्षों में, मस्तिष्क रोगों के इलाज के लिए नृवंशविज्ञान का उपयोग24,25 बढ़ रहा है। मस्तिष्क में मस्तिष्कमेरु द्रव और अंतरालीय द्रव प्राप्त करने की पारंपरिक विधि ज्यादातर रक्त संदूषण की उच्च संभावना के साथ एक बार की घटना है। सबसे महत्वपूर्ण बात, शरीर में दवाओं और उनके मेटाबोलाइट्स के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करना असंभव है। जागृत जीवों के लिए एक ऑनलाइन नमूना तकनीक के रूप में, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस में विवो, न्यूनतम इनवेसिव, एक छोटा नमूना आकार, वास्तविक समय और गतिशील होने की विशेषताएं हैं, जो पारंपरिक नमूना विधियोंके दोषों को पूरा करती हैं। आधुनिक विश्लेषण और पहचान प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त, रोग कारकों और दवा घटकों का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण अधिक सटीक रूप से आयोजित किया जा सकताहै। सामान्य तौर पर, मस्तिष्क रोगों के अध्ययन के लिए मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस शुरू करना और नृवंशविज्ञान के क्रिया तंत्र को प्रकट करना बहुत महत्वपूर्ण है।

एचईसीएफ की इन विट्रो माइक्रोडायलिसिस नमूना तकनीक को दवाओं द्वारा सीएनएस रोगों की रोकथाम और उपचार के लिए लागू किया जा सकता है। एचईसीएफ रचनाओं में परिवर्तन से जुड़ी माध्यमिक मस्तिष्क की चोटें इस्केमिक हाइपोक्सिक मस्तिष्क की चोट और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट की मृत्यु दर में वृद्धि का मुख्य कारण हैं। जवाब में, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस तकनीक पर आधारित एचईसीएफ का विश्लेषण रुग्णता और मृत्यु दर को कम करने के साथ-साथ रोग निदानमें सुधार करने के लिए गतिशील रूप से इन सीएनएस रोगों के शुरुआती बायोमाकर्स का निदान कर सकता है। उपचार के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों में दवा एकाग्रता नियमित रूप से प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के दौरान होमोजिनाइज्ड पूरे मस्तिष्क के ऊतकों को मापकर निर्धारित की जाती है, लेकिन विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में एकाग्रता का प्रत्यक्ष अवलोकन नहीं किया जा सकता है। इसे दूर करने के लिए, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में दवा सांद्रता और पैथोलॉजिकल मार्करों को मात्रात्मक रूप से मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस नमूना करण तकनीक30 के साथ संयोजन में विश्लेषण किया जा सकता है। विशेष रूप से बहु-घटक जातीय जड़ी बूटियों के लिए, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस नमूनाकरण पर आधारित रासायनिक विश्लेषण सीएनएस रोगोंके उपचार में संरचना-मस्तिष्क क्षेत्र-तंत्र के रहस्य पर ध्यान केंद्रित कर सकता है और उजागर कर सकता है। इसके अलावा, चूहे एचईसीएफ के रंग, पारदर्शिता और आसमाटिक दबाव में परिवर्तन विभिन्न रोग अवस्थाओं में हो सकता है, जैसे कि सेरेब्रल हेमरेज, ब्रेन ट्यूमर और मेनिन्जाइटिस। एचपीएलसी या मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, शोधकर्ता विभिन्न एन्सेफैलोपैथियों में एचईसीएफ संरचना में परिवर्तन निर्धारित कर सकते हैं।

सामान्य तौर पर, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस नमूना करण तकनीक सीएनएस रोगों के पैथोलॉजिकल तंत्र की जांच और नई दवाओं के विकास की सुविधा प्रदान कर सकती है। हालांकि, सिस्टम के प्रभावी अनुप्रयोग के लिए जिन बाधाओं को दूर करने की आवश्यकता है, उनमें मस्तिष्क के लक्षित क्षेत्र में माइक्रोडायलिसिस जांच के सम्मिलन के बाद आसपास के ऊतकों को नुकसान, बीबीबी विनाश की संभावना और झिल्ली14,33,34 में सीमित द्रव्यमान हस्तांतरण शामिल है। निष्कर्ष में, मस्तिष्क माइक्रोडायलिसिस तकनीक में सीएनएस रोगजनन की खोज और नई दवाओं के विकास में व्यापक अनुप्रयोग संभावनाएं हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82104533), सिचुआन प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2021वाईजे0175), और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2020 एम 683273) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक ट्राई-एंजेल्स डी एंड एच ट्रेडिंग पीटीई में एक वरिष्ठ उपकरण इंजीनियर श्री युनचेंग होंग को धन्यवाद देना चाहते हैं। माइक्रोडायलिसिस तकनीक के लिए तकनीकी सेवाएं प्रदान करने के लिए लिमिटेड (सिंगापुर)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Air-drying oven Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd GHG-9240A
Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Artificial cerebrospinal fluid Beijing leagene biotech. Co., Ltd CZ0522
Brain microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T56518
Catheter  CMA Microdialysis AB T56518
Covance infusion harness Instech Laboratories, Inc. CIH95
Denture base resins Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd 190732
Electric cranial drill Rayward Life Technology Co., Ltd 78001
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd H51021208
Iodophor Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd 202201
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Microdialysis catheter stylet  CMA Microdialysis AB 8011205
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Osmometer Löser OM 807
Sodium hyaluronate eye drops URSAPHARM Arzneimittel GmbH H20150150
Stereotaxie apparatus Rayward Life Technology Co., Ltd 68025
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T56518
Trypsin solution Boster
Biological Technology, Ltd.		 PYG0107
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 188
माइक्रोडायलिसिस सिस्टम का उपयोग करके सचेत चूहों से हिप्पोकैम्पल एक्स्ट्रासेल्युलर तरल पदार्थ का वास्तविक समय गतिशील संग्रह
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Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng, X., Hou, Y., Zhang, S. Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System. J. Vis. Exp. (188), e64530, doi:10.3791/64530 (2022).

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