Summary
这里的协议提供了使用微透析系统从清醒大鼠海马体中细胞外液的详细实时动态采样。
Abstract
多种中枢神经系统(CNS)疾病与海马细胞外液(HECF)组成的变化有关。然而,从有意识的大鼠中实时获得HECF的困难长期以来限制了CNS疾病进展的评估和民族药物治疗的有效性。令人鼓舞的是,脑微透析技术可用于连续采样,具有动态观察、定量分析和小采样量的优点。这允许监测活体动物大脑中传统草药化合物及其代谢物的细胞外液含量的变化。因此,本研究的目的是用三维脑立体定位装置将脑脊液微透析探针准确地植入Sprague Dawley(SD)大鼠的海马区域,切断大于20kDa的分子量。然后使用微透析采样控制系统从意识大鼠中获得高质量的HECF,采样速率可调为2.87 nL / min - 2.98 mL / min。综上所述,我们的方案提供了一种高效、快速、动态的方法,借助微透析技术在清醒大鼠中获取HECF,为进一步探索中枢神经系统相关疾病的发病机制和评估药物疗效提供了无限的可能性。
Introduction
高发病率的中枢神经系统(CNS)疾病,如神经退行性疾病、创伤性脑损伤、高原缺氧引起的脑损伤和缺血性脑卒中,是全球死亡率上升的主要原因1,2,3。实时监测特定大脑区域的细胞因子和蛋白质变化有助于CNS疾病的诊断准确性和用药后脑药代动力学研究。传统的科学研究使用脑组织匀浆或手动收集动物间质脑液来检测特定物质和进行药代动力学研究。但是,这有一些缺点,例如样本量有限,无法动态观察指标的变化以及采样质量不均匀4,5,6。脑脊液是一种间质液,可保护大脑和脊髓免受机械损伤。由于血脑屏障(BBB)的存在,其成分与血清的组成不同7。直接分析脑脊液样本更有利于揭示中枢神经系统病变机制和药物发现。不可避免地,通过注射器直接从大池和脑室手动获得的脑脊液样本具有血液污染,样本采集机会随机,数量不确定以及几乎没有多次检索可能性的缺点8,9。更值得注意的是,传统的间质脑液采样方法无法从受损脑区域获取样本,这阻碍了对特定脑区中枢神经系统疾病的发病机制的探索和靶向民族医学治疗的疗效评估9,10。
脑微透析是一种对清醒动物的间质脑液进行采样的技术11。微透析系统借助植入大脑的探针模仿血管通透性。微透析探针配备有半透膜,并植入特定的大脑区域。用等渗人工脑脊液(ACSF)灌注后,透析的间质脑液可以有利地收集,具有小样本量,连续采样和动态观察的优点12,13。就位置而言,脑微透析探针可以选择性地植入感兴趣的脑结构或颅骨池中14。观察到海马细胞外液(HECF)中内源性物质的异常水平提示中枢神经系统疾病的发生或疾病的发病机制。多项研究表明,中枢神经系统疾病的生物标志物,如精神分裂症中的D-氨基酸,阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白和tau蛋白,创伤性脑损伤中的神经丝轻链,以及缺氧缺血性脑病中的泛素羧基末端水解酶L1s,可以在脑脊液中分析15,16,17.基于脑微透析采样技术的化学分析方法可用于监测外源性化合物(例如民族医学的活性成分)的动态变化,这些化合物在特定大脑区域扩散和分布14。
本文介绍了清醒大鼠动态HECF采集的具体过程,并测量其渗透压以确保样品质量。
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Protocol
实验方案按照成都中医药大学实验动物使用和机构动物护理使用委员会的要求进行(备案号:2021-11)。雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(280±20g,6-8周龄)用于本研究。
1.脑微透析探针植入手术
- 分别使用3%和1.5%异氟醚诱导和维持大鼠麻醉,使用动物麻醉系统在空气 - 氧气混合物中以0.6L / min的速度进行。确保大鼠被深度麻醉,没有疼痛反射和角膜反射。在眼睛上使用兽药膏以防止麻醉时干燥。
- 在准备区域用电动剃须刀去除麻醉大鼠头骨上的皮毛。然后,将麻醉的大鼠固定在立体定位的脑定位器上。在手术前用无菌棉球将聚维酮碘和乙醇涂抹在手术区域3倍,对手术部位进行消毒。局部应用布比卡因进行局部镇痛。 注意:基于微透析的HECF样品采集的整个过程如图 1所示。
- 用手术剪刀在中间做一个1.5厘米的颅面切口,然后用手术剪刀和眼科钳取出骨膜。
- 以前胼为基底位置,刺穿颅内膜,使用颅钻在前后位 (-2 mm)、中外侧 (ML) 位置 (-3.5 mm) 和背腹 (DV) 位置 (-3.5 mm)(海马 CA1 区域)钻 2 mm 孔径。
- 将导管样式固定在立体定位脑定位器的夹具上,并调整微透析外壳在 AP (-2 mm)、ML (-3.5 mm) 和 DV (0 mm) 位置的位置。调整脑立体定位器的DV值,并将微透析外壳植入CA1区域,深度为3.5mm。
注意:在操作过程中,使用动物温度保持器将动物的温度保持在37°C。 - 再钻三个直径为2毫米的孔,使三个孔形成一个三角形,探头孔径位于其中的中心。将螺钉植入深度为 1 mm 的孔中。
- 用牙科水泥固定探针导管,并使用4-0手术缝合线闭合皮肤。有关探头的放置,请参见 图2 。
- 将大鼠放在笼子里7天以恢复。术后布比卡因(1.5 mg/kg)局部浸润,每日一次。 随意提供食物和水。每天使用透明质酸钠滴眼液3次,以防止手术后干燥。
注意:在无菌手术室中执行所有程序。在动物恢复足够的意识以在 37°C 条件下保持胸骨卧位之前,不要让动物无人看管。在完全康复之前,不要将接受手术的动物送回其他动物的陪伴下。
2. 微透析系统连接和探头检查
- 根据制造商的说明连接微量透析泵、微量注射器、清醒活动装置和低温样品收集器。将带有ACSF的微量注射器安装在微量透析泵上,并将微量透析泵设置为1μL / min的速率以排出管道中的空气。
- 连接管道和脑微透析探头(膜:PAES;膜长度:4毫米;膜外径:0.5毫米;截止:20 kDa;轴长:14毫米)。以 1 μL/min 的速率操作微透析泵,将 ACSF 注入探针,直到探针表面略微湿润。将探针浸入肝素钠注射液中以供后续使用。
注意: 如果ACSF的大流从探头的半透膜上掉下来,如肉眼在重力作用下看到的那样,请更换新探头。
3. 从清醒大鼠身上收集HECF
- 将脑微透析探针插入探针导管,并将大鼠放入带有衬垫的腔室(高度:360毫米;直径:400毫米)中,以确保大鼠可以自由移动。
- 连接管道、微量注射泵和脑微透析探头。通过捕鼠装置顶部的孔和不锈钢旋转装置 来 驾驭老鼠。
- 打开多通道旋转控制器,以避免在大鼠自由运动期间缠绕微透析管道。打开微量注射器泵并以 1 μL/min 的速率泵送 ACSF。在微透析HECF收集系统平衡60分钟后定期收集HECF。
- 确保冷藏馏分收集器中HECF样品的流速与ACSF输注一致。收集 20 μL HECF 并自动更换到下一个采样管。插入探头时,请注意检查探针膜是否损坏。
4. 测量HECF的渗透压
- 打开渗透压计并登录到检测系统。单击触摸屏上的 Cal 按钮,然后单击页面上的 Res 按钮以清除之前的校准存储器。
- 在测量头上安装一个装有 100 μL 纯水且无气泡的 1.5 mL 管。将测量头拉到冷肼容器的底部。
- 在触摸屏上输入样品编号 0 并确认进行测试。迅速将二极管针浸入样品管中,然后迅速将其拉出以在-6.2°C的温度下诱导样品结晶。
- 等待屏幕显示:向上推测量头,依次单击 Cal 和 Cal 0 进行校准。如上所述,使用300 mOsm校准溶液进行测量,并测量HECF样品的渗透压。
注意:校准或测量后,用软纸巾擦拭测量头。没有气泡的HECF样品应充分混合。
5. 取样后微透析系统和设备的维护
- 取样终止后从探头导管中取出脑微透析探针。将探头浸入去离子水中,并用去离子水灌洗12小时,以去除管道和探头上的搁浅盐沉积物。
- 取出探针以置于4°C的0.05%胰蛋白酶溶液中。 在25°C的风干烤箱中干燥管道,并在室温下储存。
注意:微透析探头价格昂贵,此步骤可以提高探头的可重复使用性。粘附在探针表面的蛋白质可以被胰蛋白酶溶液消化,防止探针膜被蛋白质堵塞,胰蛋白酶对探针材料没有影响。
6. 取样后的动物处理
- 取样后,通过让大鼠吸入1.5%异氟醚来无痛地对大鼠实施安乐死,然后根据动物伦理学过量服用5%异氟醚。
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Representative Results
按照上述实验方案和 表1中设置的采样参数,以设定的采样速率获得水状,无色和透明的大鼠HECF(图1K)。所得大鼠HECF的渗透压为290-310 mOsm/L,可间接保证样品18,19的质量。
图1:使用微透析采样设备收集的大鼠HECF 。 (A,B)使用动物麻醉系统和数字显示立体定位装置麻醉和固定大鼠。(C)微透析系统取样收集管。(D)大鼠的颅骨解剖结构清楚地显示了前膛和ξ状缝合。(五)导管探针和脑微透析探头,展示探头的透析膜和钢轴。(F)应用微量透析探针的 体外 固定栈台来储存和清洁探针。(七)四注射器液体输送注射泵。(H, I)系统上的不锈钢旋转接头和多通道旋转控制器,可自由移动动物。(J)双通道冷藏馏分收集器。(K)通过微透析获得大鼠HECF。(L)大鼠自由移动的水箱。(M)微量透析取样系统的相关部件-。 请点击此处查看此图的大图。
图2:嵌入大鼠脑海马区域的脑微透析探针示意图。 三个孔形成一个三角形,探头孔位于中央。 请点击此处查看此图的大图。
参数项 | 价值 |
灌注率 | 1 微升/分钟 |
采样率 | 1 微升/分钟 |
采样温度 | 4°C |
表1:微透析脑脊液采样系统的设置参数。
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Discussion
中枢神经系统疾病的发病机制尚未完全了解,这阻碍了新疗法和药物的开发。研究表明,大多数中枢神经系统疾病与海马病变密切相关20,21,22。所提出的脑微透析技术可以针对大脑的特定区域,尤其是海马体,这使得它从传统的收集HECF的方法中脱颖而出。通过植入手术将探针放置在大鼠大脑的CA1区域,以通过人造膜的被动扩散分离特定大小的分子。探针的植入是一个关键步骤,其中探针的任何损坏和脑组织(例如蛋白质)的任何局部损伤聚集体23(可能是由探针植入引起的)都将导致实验失败或测量不准确性增加。因此,必须检查探针的完整性,并在微透析探针植入手术后给动物一个适当的恢复期。
近年来,民族医学用于治疗脑部疾病的使用一直在增长24,25。在大脑中获取脑脊液和间质液的传统方法大多是一次性事件,血液污染的可能性很高8,9。最重要的是,不可能观察到药物及其代谢物在体内的动态变化。脑微透析作为一种针对清醒生物的在线采样技术,具有体内、微创、样本量小、实时、动态等特点,弥补了传统采样方法的缺陷26。结合现代分析和检测技术,可以更准确地对疾病因素和药物成分进行定性和定量分析27。总的来说,引入脑微透析对脑部疾病的研究并揭示民族医学的作用机制具有重要意义。
HECF体 外 微透析取样技术可应用于药物预防和治疗中枢神经系统疾病。涉及HECF成分变化的继发性脑损伤是缺血性缺氧性脑损伤和创伤性脑损伤死亡率增加的主要原因。作为回应,基于脑微透析技术的HECF分析可以动态诊断这些CNS疾病的早期生物标志物,以降低发病率和死亡率,并改善预后28,29。治疗后,通过在临床前研究中测量均质的全脑组织来常规测定脑组织中的药物浓度,但不能直接观察特定脑区域的浓度。为了克服这个问题,可以结合脑微透析采样技术定量分析特定大脑区域中的药物浓度和病理标志物30。特别是对于多组分民族草药,基于脑微透析采样的化学分析可以聚焦并揭示组成 - 脑区域 - 机制在治疗CNS疾病中的奥秘31,32。此外,大鼠HECF的颜色,透明度和渗透压的变化可能发生在不同的疾病状态,例如脑出血,脑肿瘤和脑膜炎。使用HPLC或质谱法,研究人员可以确定不同脑病中HECF组成的变化。
一般来说,脑微透析采样技术可以促进中枢神经系统疾病病理机制的研究和新药的开发。然而,为了有效应用该系统,需要克服的进一步限制包括将微透析探针插入大脑目标区域后对周围组织的损伤,BBB破坏的可能性以及跨膜的有限传质14,33,34。综上所述,脑微透析技术在中枢神经系统发病机制探索和新药开发方面具有广阔的应用前景。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(82104533)、四川省科技厅(2021YJ0175)和中国博士后科学基金(2020M683273)的支持。作者要感谢Tri-Angels D&H Trading Pte的高级设备工程师Yuncheng Hong先生。Ltd.(新加坡)为微透析技术提供技术服务。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
Osmometer | Löser | OM 807 | |
Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
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