Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode
Summary
Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.
Abstract
Bij bloeiende planten zijn de groei en begeleiding van de stuifmeelbuis (mannelijke gametofyt) in de stamper en de ontvangst van de stuifmeelbuis door de vrouwelijke gametofyt essentieel voor dubbele bevruchting en daaropvolgende zaadontwikkeling. De interacties tussen mannelijke en vrouwelijke gametofyten tijdens de ontvangst van de stuifmeelbuis culmineren in stuifmeelbuisruptuur en de afgifte van twee zaadcellen om dubbele bevruchting te bewerkstelligen. Omdat stuifmeelbuisgroei en dubbele bevruchting diep verborgen zijn in de weefsels van de bloem, is dit proces moeilijk in vivo waar te nemen.
Een semi-in vitro (SIV) methode voor de live-cell imaging van bevruchting in de modelplant Arabidopsis thaliana is ontwikkeld en geïmplementeerd in verschillende onderzoeken. Deze studies hebben geholpen om de fundamentele kenmerken op te helderen van hoe het bevruchtingsproces plaatsvindt in bloeiende planten en welke cellulaire en moleculaire veranderingen optreden tijdens de interactie van de mannelijke en vrouwelijke gametofyten. Omdat deze live cell imaging-experimenten echter de excisie van individuele eicellen omvatten, zijn ze beperkt tot een laag aantal observaties per beeldvormingssessie, waardoor deze aanpak vervelend en zeer tijdrovend is. Naast andere technische problemen wordt vaak een falen van de stuifmeelbuizen om de eicellen in vitro te bevruchten gemeld, wat dergelijke analyses ernstig verstoort.
Hier wordt een gedetailleerd videoprotocol geleverd voor het in beeld brengen van de ontvangst en bevruchting van pollenbuizen op een geautomatiseerde en high-throughput manier, waardoor tot 40 observaties van pollenbuisontvangst en -breuk per beeldvormingssessie mogelijk zijn. In combinatie met het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren en markerlijnen maakt deze methode het genereren van grote steekproefgroottes mogelijk met een verminderde tijdsinvestering. Nuances en kritische punten van de techniek, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvorming, zijn duidelijk gedetailleerd in videoformaat om toekomstig onderzoek naar de dynamiek van pollenbuisgeleiding, ontvangst en dubbele bevruchting te vergemakkelijken.
Introduction
Het genereren van genetisch unieke nakomelingen in seksueel reproducerende organismen is afhankelijk van de succesvolle fusie van mannelijke en vrouwelijke gameten. In bloeiende planten is de interactie van twee mannelijke gameten (zaadcellen) met twee vrouwelijke gameten (eicel en centrale cel) tijdens dubbele bevruchting afhankelijk van de afgifte van sperma uit de stuifmeelbuis (de mannelijke gametofyt). Dit proces, de ontvangst van stuifmeelbuizen, wordt grotendeels gecontroleerd door de synergetische cellen die zich in de embryozak (de vrouwelijke gametofyt) bevinden1,2. Omdat de ontvangst van stuifmeelbuizen diep in de bloem plaatsvindt, is eenmethode vastgesteld die live-cell imaging van het proces mogelijk maakt, genaamd semi-in vitro (SIV) pollenbuisontvangst, 3. Met deze methode worden weggesneden Arabidopsis-eitjes op semi-vloeibaar stuifmeelkiemmedium geplaatst en gericht op stuifmeelbuizen die groeien door het stigma en de stijl van een stamper die is afgesneden op de stijloverlatende tractusjunctie 3,4. Sinds de ontwikkeling van deze techniek hebben gedetailleerde waarnemingen geleid tot verschillende ontdekkingen rond pollenbuisgeleiding, ontvangst en bevruchting. Deze ontdekkingen omvatten onder andere de verwerving van stuifmeelbuisgericht competentie door groei door het stigma3, het begin van intracellulaire calciumoscillaties in de synergiden bij aankomst van de stuifmeelbuis 5,6,7,8,9, en de dynamiek van het vrijgeven en bevruchten van zaadcellen bij stuifmeelbuisuitbarsting10 . Niettemin, omdat deze techniek afhankelijk is van de excisie van eicellen, zijn de waarnemingen van bevruchting beperkt in aantal en is de ontvangst van stuifmeelbuizen vaak afwijkend, wat resulteert in het falen van stuifmeelbuisruptuur (Video 1 en Aanvullend Dossier 1). Daarom is er behoefte aan een efficiëntere aanpak die analyses met een hoge doorvoer van de ontvangst en bemesting van pollenbuizen mogelijk maakt.
Bij de ontwikkeling van dit protocol werden verschillende nieuwe benaderingen voor het analyseren van pollenbuisontvangst, variërend van de meest “in vitro” tot de meest “in vivo” -methoden, getest en werd een efficiënte techniek op basis van de excisie van het hele septum vastgesteld, die tot 40 observaties van bevruchting per dag mogelijk maakt. Hier worden de nuances en kritische punten van de techniek geschetst, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvormingsinstellingen. Door dit protocol te volgen, moet onderzoek gericht op pollenbuisgeleiding, pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting worden vergemakkelijkt. De hogere steekproefgroottes die de methode mogelijk maakt, zullen naar verwachting de wetenschappelijke deugdelijkheid van de conclusies uit live beeldvormingsexperimenten versterken. De mogelijke toepassingen van deze techniek omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het uitvoeren van observaties van de moleculaire en fysiologische veranderingen in cytosolische calciumconcentraties ([Ca2+]cyt), pH ofH 2 O2 tijdens gametofyteninteracties door het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren. Bovendien kunnen cytologische veranderingen, zoals degeneratie van de receptieve synergie, spermacelmigratie of karyogamie, gemakkelijker worden waargenomen met behulp van deze verbeterde methode. Ten slotte kan de timing van de verschillende stadia van bevruchting worden gevolgd onder widefieldmicroscopie, en vervolgens kunnen meer gedetailleerde analyses met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) of tweefoton excitatiemicroscopie (2PEM) worden uitgevoerd voor een hogere resolutie en 3D-reconstructie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript introduceert een efficiënt protocol voor de beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting in Arabidopsis. De verbeterde methode, SIV cum septum, verhoogt het percentage en het totale aantal succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen die per beeldvormingssessie waarneembaar zijn, aanzienlijk. De hier getoonde representatieve resultaten tonen een beeldvormingssessie met 41 succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen en 10 eicellen die ontvangstdefecten vertonen (~ 80% ef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Sara Simonini en Stefano Bencivenga voor het doneren van de pFG:roGFP2-ORP1-NLS construct en Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter en Celia Baroux voor hun advies over microscopie. We erkennen vriendelijk het advies van Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima en alle anderen op de International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 die interesse toonden in een protocol over SIV cum septum. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Zürich en subsidies van de Swiss National Science Foundation aan U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
