Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum
Summary
Aqui, descrevemos um aprimoramento do método semi-in vitro (SIV) para observação da orientação e recepção do tubo polínico em Arabidopsis thaliana, que aumenta a receptividade dos óvulos. O método SIV cum septum de alto rendimento pode ser acoplado a linhagens de marcadores gametófitos e biossensores codificados geneticamente para monitorar o processo dinâmico de fertilização.
Abstract
Em plantas com flores, o crescimento e a orientação do tubo polínico (gametófito masculino) dentro do pistilo e a recepção do tubo polínico pelo gametófito feminino são essenciais para a dupla fertilização e posterior desenvolvimento das sementes. As interações entre gametófitos masculinos e femininos durante a recepção do tubo polínico culminam na ruptura do tubo polínico e na liberação de dois espermatozoides para efetuar a dupla fecundação. Como o crescimento do tubo polínico e a dupla fertilização estão profundamente ocultos nos tecidos da flor, esse processo é difícil de observar in vivo.
Um método semi-in vitro (SIV) para obtenção de imagens em células vivas da fertilização na planta-modelo Arabidopsis thaliana tem sido desenvolvido e implementado em diversas investigações. Esses estudos têm ajudado a elucidar as características fundamentais de como ocorre o processo de fertilização em plantas com flores e quais mudanças celulares e moleculares ocorrem durante a interação dos gametófitos masculino e feminino. No entanto, como esses experimentos de imagem de células vivas envolvem a excisão de óvulos individuais, eles são limitados a um baixo número de observações por sessão de imagem, tornando essa abordagem tediosa e muito demorada. Entre outras dificuldades técnicas, é frequentemente relatada a falha dos tubos polínicos em fertilizar os óvulos in vitro , o que confunde severamente tais análises.
Aqui, um protocolo de vídeo detalhado para a obtenção de imagens da recepção e fertilização do tubo polínico de forma automatizada e de alto rendimento é fornecido, permitindo até 40 observações de recepção e ruptura do tubo polínico por sessão de imagem. Aliado ao uso de biossensores e linhagens de marcadores codificados geneticamente, esse método possibilita a geração de grandes tamanhos amostrais com reduzido investimento de tempo. Nuances e pontos críticos da técnica, incluindo estadiamento floral, dissecção, preparação do meio e imagem, são claramente detalhados em formato de vídeo para facilitar futuras pesquisas sobre a dinâmica de orientação, recepção e fertilização dupla do tubo polínico.
Introduction
A geração de descendentes geneticamente únicos em organismos sexualmente reprodutores depende da fusão bem sucedida de gametas masculinos e femininos. Em plantas com flores, a interação de dois gametas masculinos (espermatozoides) com dois gametas femininos (óvulo e célula central) durante a dupla fecundação depende da liberação de espermatozoides do tubo polínico (o gametófito masculino). Esse processo, denominado recepção do tubo polínico, é amplamente controlado pelas células sinérgicas que residem no saco embrionário (o gametófito feminino)1,2. Como a recepção do tubo polínico ocorre profundamente no interior da flor, um método que permite a obtenção de imagens em células vivas do processo, denominado recepção do tubo polínico semi-in vitro (SIV), foi estabelecido3. Com esse método, óvulos de Arabidopsis excisados são colocados em meio de germinação de pólen semilíquido e alvo de tubos polínicos que crescem através do estigma e estilo de um pistilo cortado na junção do trato transmissordo estilo 3,4. Desde o desenvolvimento desta técnica, observações detalhadas levaram a várias descobertas em torno da orientação, recepção e fertilização do tubo polínico. Entre outras, essas descobertas incluem a aquisição de competências de direcionamento do tubo polínico pelo crescimento através do estigma3, o aparecimento de oscilações intracelulares de cálcio nos sinergídeos com a chegada do tubo polínico 5,6,7,8,9 e a dinâmica de liberação e fertilização dos espermatozoides após a ruptura do tubo polínico10 . No entanto, como essa técnica depende da excisão dos óvulos, as observações de fertilização são limitadas em número, e a recepção do tubo polínico é frequentemente aberrante, resultando na falha da ruptura do tubo polínico (Vídeo 1 e Arquivo Suplementar 1). Portanto, há necessidade de uma abordagem mais eficiente que permita análises de alto rendimento da recepção e fertilização do tubo polínico.
No desenvolvimento desse protocolo, várias novas abordagens para analisar a recepção do tubo polínico, desde os métodos mais “in vitro” até os mais “in vivo“, foram testadas, e uma técnica eficiente baseada na excisão de todo o septo foi estabelecida, o que permite até 40 observações de fertilização por dia. Aqui, as nuances e os pontos críticos da técnica são delineados, incluindo estadiamento floral, dissecção, preparação do meio e configurações de imagem. Seguindo esse protocolo, pesquisas com foco na orientação do tubo polínico, recepção do tubo polínico e dupla fertilização devem ser facilitadas. Espera-se que os tamanhos de amostra mais altos que o método permite reforcem a solidez científica das conclusões tiradas de experimentos de imagens ao vivo. As aplicações potenciais desta técnica incluem, mas não estão limitadas a, realizar observações das mudanças moleculares e fisiológicas nas concentrações citosólicas de cálcio ([Ca2+]cyt), pH ou H2 O2 durante interações gametófitas através do uso de biossensores codificados geneticamente. Além disso, alterações citológicas, como degeneração do sinérgico receptivo, migração de células espermáticas ou cariogamia, podem ser mais facilmente observadas usando este método melhorado. Finalmente, o tempo dos diferentes estágios de fertilização pode ser monitorado sob microscopia de campo largo e, em seguida, análises mais detalhadas usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) ou microscopia de excitação de dois fótons (2PEM) podem ser conduzidas para maior resolução e reconstrução 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito apresenta um protocolo eficiente para obtenção de imagens de recepção de tubo polínico e dupla fertilização em Arabidopsis. O método aprimorado, SIV cum septum, aumenta consideravelmente a porcentagem e o número total de eventos bem-sucedidos de recepção do tubo polínico que são observáveis por sessão de imagem. Os resultados representativos mostrados aqui demonstram uma sessão de imagem com 41 eventos bem-sucedidos de recepção do tubo polínico e 10 óvulos mostrando d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sara Simonini e Stefano Bencivenga pela doação do construto pFG:roGFP2-ORP1-NLS e a Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter e Celia Baroux por seus conselhos sobre microscopia. Agradecemos gentilmente os conselhos de Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima e todos os outros na Conferência Internacional sobre Reprodução Sexual de Plantas 2022 que mostraram interesse em um protocolo sobre SIV cum septum. Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique e subsídios da Fundação Nacional de Ciência da Suíça para a U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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