הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum
Summary
כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.
Abstract
בצמחים פורחים, הצמיחה וההכוונה של צינור האבקה (גמטופיט זכרי) בתוך הפיסטיל וקליטת צינור האבקה על ידי נקבת הגמטופיט חיוניים להפריה כפולה ולהתפתחות זרעים לאחר מכן. יחסי הגומלין בין הגמטופיטים הזכריים והנקביים במהלך קליטת צינור האבקה מגיעים לשיאם בקרע של צינור האבקה ובשחרור שני תאי זרע כדי לגרום להפריה כפולה. מכיוון שצמיחת צינור האבקה וההפריה הכפולה חבויים עמוק בתוך רקמות הפרח, קשה להבחין בתהליך זה in vivo.
שיטת SIV (Semi-in vitro ) להדמיית תאים חיים של דישון בצמח המודל Arabidopsis thaliana פותחה ויושמה במספר חקירות. מחקרים אלה סייעו להבהיר את המאפיינים הבסיסיים של האופן שבו תהליך ההפריה מתרחש בצמחים פורחים ואילו שינויים תאיים ומולקולריים מתרחשים במהלך האינטראקציה של הגמטופיטים הזכריים והנקביים. עם זאת, מכיוון שניסויי הדמיה אלה של תאים חיים כרוכים בכריתה של ביציות בודדות, הם מוגבלים למספר נמוך של תצפיות בכל מפגש הדמיה, מה שהופך גישה זו למייגעת וגוזלת זמן רב. בין שאר הקשיים הטכניים, לעתים קרובות מדווח על כישלון של צינורות האבקה להפרות את הביציות במבחנה, מה שמבלבל מאוד ניתוחים כאלה.
כאן, פרוטוקול וידאו מפורט להדמיית קליטה והפריה של צינור אבקה באופן אוטומטי ובתפוקה גבוהה, המאפשר עד 40 תצפיות של קליטת צינור אבקה וקרע בכל מפגש הדמיה. בשילוב עם השימוש בחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית וקווי סמן, שיטה זו מאפשרת יצירת דגימות גדולות בהשקעת זמן מופחתת. ניואנסים ונקודות קריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והדמיה, מפורטים בבירור בפורמט וידאו כדי להקל על מחקר עתידי על הדינמיקה של הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה כפולה.
Introduction
יצירת צאצאים ייחודיים גנטית באורגניזמים המתרבים מינית תלויה באיחוי מוצלח של גמטות זכריות ונקביות. בצמחים פורחים, האינטראקציה של שתי גמטות זכריות (תאי זרע) עם שתי גמטות נקביות (תא ביצית ותא מרכזי) במהלך הפריה כפולה תלויה בשחרור זרע מצינור האבקה (הגמטופיט הגברי). תהליך זה, הנקרא קליטת צינור אבקה, נשלט במידה רבה על ידי התאים הסינרגידים השוכנים בתוך שק העובר (הגמטופיט הנשי)1,2. מכיוון שקליטת צינור האבקה מתרחשת עמוק בתוך הפרח, נקבעה שיטה המאפשרת הדמיה של תאים חיים של התהליך, הנקראת קליטת צינור אבקה למחצה במבחנה (SIV). בשיטה זו, ביציות Arabidopsis נכרתו מונחות על מדיום נביטת אבקה נוזלי למחצה וממוקדות על ידי צינורות אבקה הגדלים דרך הצלקת והסגנון של פיסטיל שנקטע בצומת דרכי העברת הסגנון 3,4. מאז פיתוח טכניקה זו, תצפיות מפורטות הובילו למספר תגליות סביב הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה. בין היתר, תגליות אלה כוללות רכישת יכולת מיקוד של צינור אבקה על ידי צמיחה באמצעות סטיגמה3, הופעת תנודות סידן תוך תאיות בסינרגידים עם הגעת צינור האבקה 5,6,7,8,9, והדינמיקה של שחרור תאי זרע והפריה עם פיצוץ צינור אבקה 10 . עם זאת, מכיוון שטכניקה זו מסתמכת על כריתת ביציות, התצפיות על ההפריה מוגבלות במספרן, וקליטת צינור האבקה היא לעתים קרובות חריגה, וכתוצאה מכך כישלון של קרע בצינור האבקה (וידאו 1 וקובץ משלים 1). לכן, יש צורך בגישה יעילה יותר המאפשרת ניתוחים בתפוקה גבוהה של קליטת צינור אבקה והפריה.
בפיתוח פרוטוקול זה, נבדקו מספר גישות חדשות לניתוח קליטת צינור אבקה, החל מהשיטות ה”חוץ גופיות” ביותר ועד לשיטות “in vivo” ביותר, והוחלט על טכניקה יעילה המבוססת על כריתה של המחיצה כולה, המאפשרת עד 40 תצפיות של הפריה ביום. כאן מתוארים הניואנסים והנקודות הקריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והגדרות הדמיה. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, יש להקל על מחקר המתמקד בהנחיית צינור אבקה, קליטת צינור אבקה והפריה כפולה. גודל הדגימות הגבוה יותר שהשיטה מאפשרת צפוי לחזק את האיתנות המדעית של המסקנות שהוסקו מניסויי הדמיה חיים. היישומים האפשריים של טכניקה זו כוללים, אך אינם מוגבלים, לביצוע תצפיות של השינויים המולקולריים והפיזיולוגיים בריכוזי סידן ציטוסולי ([Ca2+]cyt), pH, או H 2 O2 במהלךאינטראקציות gametophyte באמצעות שימוש biosensors מקודדים גנטית. יתר על כן, שינויים ציטולוגיים, כגון ניוון של סינרגיד הקבלה, נדידת תאי זרע, או קאריוגמיה, ניתן לראות בקלות רבה יותר באמצעות שיטה משופרת זו. לבסוף, ניתן לעקוב אחר העיתוי של שלבי ההפריה השונים תחת מיקרוסקופ שדה רחב, ולאחר מכן ניתן לבצע ניתוחים מפורטים יותר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) או מיקרוסקופ עירור שני פוטונים (2PEM) לרזולוציה גבוהה יותר ולשחזור תלת ממדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מציג פרוטוקול יעיל להדמיית קליטת צינור אבקה והפריה כפולה בארבידופסיס. השיטה המשופרת, SIV cum septum, מגדילה מאוד את האחוז ואת המספר הכולל של אירועי קליטה מוצלחים של צינור אבקה הניתנים לצפייה בכל מפגש הדמיה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן מדגימות מפגש הדמיה עם 41 אירועי קליטה מוצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לשרה סימוניני וסטפנו בנסיוונגה על תרומת מבנה pFG:roGFP2-ORP1-NLS ולכריסטוף אייכנברגר, יוהאן אלמנדינגר, וינסנט סאטר וסיליה בארו על עצתם בנושא מיקרוסקופיה. אנו מודים בחביבות לעצות של ראווי פלניבלו, פיליפ דנינגר, שרון קסלר, מארק ג’ונסון, טומוקזו קוואשימה וכל שאר המשתתפים בכנס הבינלאומי לרבייה מינית של צמחים 2022 שהביעו עניין בפרוטוקול על SIV cum septum. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך ומענקים מהקרן הלאומית למדע של שווייץ ל- U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
