Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode
Summary
Hier beschreiben wir eine Verbesserung der Semi-in-vitro (SIV) Methode zur Beobachtung der Pollenschlauchführung und -aufnahme bei Arabidopsis thaliana, die die Empfänglichkeit der Eizellen erhöht. Die Hochdurchsatz-SIV-cum-Septum-Methode kann mit Gametophyten-Markerlinien und genetisch kodierten Biosensoren gekoppelt werden, um den dynamischen Prozess der Befruchtung zu überwachen.
Abstract
Bei Blütenpflanzen sind das Wachstum und die Führung des Pollenschlauchs (männlicher Gametophyt) innerhalb des Stempels und die Aufnahme des Pollenschlauchs durch den weiblichen Gametophyten essentiell für die Doppelbefruchtung und die anschließende Samenentwicklung. Die Interaktionen zwischen männlichen und weiblichen Gametophyten während der Pollenschlauchaufnahme gipfeln in einem Pollenschlauchriss und der Freisetzung von zwei Samenzellen, um eine doppelte Befruchtung zu bewirken. Da das Wachstum der Pollenschläuche und die doppelte Befruchtung tief im Gewebe der Blüte verborgen sind, ist dieser Prozess in vivo schwer zu beobachten.
Eine semi-in vitro (SIV) Methode zur Lebendzell-Bildgebung der Befruchtung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurde entwickelt und de mehreren Untersuchungen umgesetzt. Diese Studien haben dazu beigetragen, die grundlegenden Merkmale aufzuklären, wie der Befruchtungsprozess in Blütenpflanzen abläuft und welche zellulären und molekularen Veränderungen während der Interaktion der männlichen und weiblichen Gametophyten auftreten. Da diese Lebendzell-Imaging-Experimente jedoch die Exzision einzelner Eizellen beinhalten, sind sie auf eine geringe Anzahl von Beobachtungen pro Bildgebungssitzung beschränkt, was diesen Ansatz mühsam und sehr zeitaufwändig macht. Neben anderen technischen Schwierigkeiten wird häufig über ein Versagen der Pollenschläuche bei der Befruchtung der Eizellen in vitro berichtet, was solche Analysen stark beeinträchtigt.
Hier wird ein detailliertes Videoprotokoll für die Bildgebung der Pollenschlauchaufnahme und -befruchtung in einer automatisierten und Hochdurchsatzmethode bereitgestellt, das bis zu 40 Beobachtungen der Pollenschlauchaufnahme und -ruptur pro Bildgebungssitzung ermöglicht. In Verbindung mit dem Einsatz von genetisch kodierten Biosensoren und Markerlinien ermöglicht diese Methode die Generierung großer Stichprobengrößen mit reduziertem Zeitaufwand. Nuancen und kritische Punkte der Technik, einschließlich der Inszenierung von Blüten, der Präparation des Mediums und der Bildgebung, werden im Videoformat klar detailliert beschrieben, um zukünftige Forschungen zur Dynamik der Pollenschlauchführung, -aufnahme und -befruchtung zu erleichtern.
Introduction
Die Erzeugung genetisch einzigartiger Nachkommen in sexuell reproduzierenden Organismen hängt von der erfolgreichen Verschmelzung männlicher und weiblicher Gameten ab. Bei Blütenpflanzen hängt die Interaktion zweier männlicher Gameten (Samenzellen) mit zwei weiblichen Gameten (Eizelle und Zentralzelle) während der Doppelbefruchtung von der Spermienfreisetzung aus dem Pollenschlauch (dem männlichen Gametophyten) ab. Dieser Prozess, der als Pollenschlauchempfang bezeichnet wird, wird weitgehend von den synergistischen Zellen gesteuert, die sich im Embryosack befinden (dem weiblichen Gametophyten)1,2. Da die Pollenschlauchaufnahme tief im Inneren der Blüte stattfindet, wurde eine Methode etabliert, die eine Bildgebung des Prozesses in lebenden Zellen ermöglicht, die als Semi-in-vitro (SIV) Pollenschlauchempfang bezeichnetwird 3. Bei dieser Methode werden herausgeschnittene Arabidopsis-Eizellen auf halbflüssiges Pollenkeimmedium gelegt und von Pollenschläuchen angegriffen, die durch das Stigma und den Stil eines Stempels wachsen, der an der stilübertragenden Traktverbindung 3,4 durchtrennt wird. Seit der Entwicklung dieser Technik haben detaillierte Beobachtungen zu mehreren Entdeckungen in Bezug auf die Führung, Aufnahme und Befruchtung von Pollenschläuchen geführt. Zu diesen Entdeckungen gehören unter anderem der Erwerb von Pollenschlauch-Targeting-Kompetenz durch Wachstum durch das Stigma3, das Einsetzen intrazellulärer Calciumoszillationen in den Synergieden bei Pollenschlauchankunft 5,6,7,8,9 und die Dynamik der Spermienfreisetzung und Befruchtung nach Pollenschlauchplatzen10 . Da diese Technik jedoch auf der Entfernung von Eizellen beruht, sind die Beobachtungen der Befruchtung in ihrer Anzahl begrenzt, und die Pollenschlauchaufnahme ist oft abweichend, was zum Versagen der Pollenschlauchruptur führt (Video 1 und Zusatzdatei 1). Daher besteht ein Bedarf an einem effizienteren Ansatz, der Hochdurchsatzanalysen der Pollenschlauchaufnahme und -befruchtung ermöglicht.
Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere neue Ansätze zur Analyse des Pollenschlauchempfangs getestet, die von den meisten “in vitro“- bis zu den “in vivo“-Methoden reichen, und es wurde eine effiziente Technik entwickelt, die auf der Exzision des gesamten Septums basiert und bis zu 40 Befruchtungsbeobachtungen pro Tag ermöglicht. Hier werden die Nuancen und kritischen Punkte der Technik skizziert, einschließlich der Inszenierung von Blumen, der Dissektion, der Vorbereitung des Mediums und der Bildgebungseinstellungen. Durch die Befolgung dieses Protokolls sollte die Forschung mit Schwerpunkt auf der Pollenschlauchführung, der Pollenschlauchaufnahme und der Doppelbefruchtung erleichtert werden. Es wird erwartet, dass die höheren Stichprobengrößen, die die Methode ermöglicht, die wissenschaftliche Solidität der Schlussfolgerungen aus Live-Bildgebungsexperimenten stärken. Zu den möglichen Anwendungen dieser Technik gehören unter anderem die Durchführung von Beobachtungen der molekularen und physiologischen Veränderungen der zytosolischen Calciumkonzentrationen ([Ca 2+ ]cyt), des pH-Werts oder H 2 O2während Gametophyteninteraktionen unter Verwendung genetisch kodierter Biosensoren. Darüber hinaus können zytologische Veränderungen, wie z.B. die Degeneration des rezeptiven Synergieds, die Migration von Samenzellen oder die Karyogamie, mit dieser verbesserten Methode leichter beobachtet werden. Schließlich kann das Timing der verschiedenen Stadien der Befruchtung unter Weitfeldmikroskopie überwacht werden, und dann können detailliertere Analysen mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) oder Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie (2PEM) für eine höhere Auflösung und 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript stellt ein effizientes Protokoll für die Bildgebung der Pollenschlauchaufnahme und der Doppelbefruchtung bei Arabidopsis vor. Die verbesserte Methode, SIV cum septum, erhöht den Prozentsatz und die Gesamtzahl der erfolgreichen Pollenschlauch-Empfangsereignisse, die pro Bildgebungssitzung beobachtbar sind, erheblich. Die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse zeigen eine Bildgebungssitzung mit 41 erfolgreichen Pollenschlauchempfangsereignissen und 10 Eizellen, die Empfangsdefekte …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sara Simonini und Stefano Bencivenga für die Spende des pFG:roGFP2-ORP1-NLS-Konstrukts und Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter und Celia Baroux für ihre Beratung zur Mikroskopie. Wir danken den Ratschlägen von Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima und allen anderen auf der International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022, die Interesse an einem Protokoll über SIV cum Septum gezeigt haben. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich und Beiträgen des Schweizerischen Nationalfonds an die U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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