Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum
Summary
Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.
Abstract
Chez les plantes à fleurs, la croissance et le guidage du tube pollinique (gamétophyte mâle) dans le pistil et la réception du tube pollinique par le gamétophyte femelle sont essentiels pour la double fécondation et le développement ultérieur des graines. Les interactions entre les gamétophytes mâles et femelles lors de la réception du tube pollinique aboutissent à la rupture du tube pollinique et à la libération de deux spermatozoïdes pour effectuer une double fécondation. Comme la croissance des tubes polliniques et la double fécondation sont profondément cachées dans les tissus de la fleur, ce processus est difficile à observer in vivo.
Une méthode semi-in vitro (SIV) pour l’imagerie de la fécondation sur cellules vivantes dans la plante modèle Arabidopsis thaliana a été développée et mise en œuvre dans plusieurs études. Ces études ont permis d’élucider les caractéristiques fondamentales de la façon dont le processus de fécondation se produit chez les plantes à fleurs et quels changements cellulaires et moléculaires se produisent lors de l’interaction des gamétophytes mâles et femelles. Cependant, comme ces expériences d’imagerie de cellules vivantes impliquent l’excision d’ovules individuels, elles sont limitées à un faible nombre d’observations par séance d’imagerie, ce qui rend cette approche fastidieuse et très longue. Entre autres difficultés techniques, une défaillance des tubes polliniques pour féconder les ovules in vitro est souvent signalée, ce qui complique gravement de telles analyses.
Ici, un protocole vidéo détaillé pour l’imagerie de la réception et de la fécondation des tubes polliniques de manière automatisée et à haut débit est fourni, permettant jusqu’à 40 observations de la réception et de la rupture du tube pollinique par séance d’imagerie. Couplée à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés et de lignes de marqueurs, cette méthode permet de générer des échantillons de grande taille avec un investissement en temps réduit. Les nuances et les points critiques de la technique, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et l’imagerie, sont clairement détaillés sous forme vidéo pour faciliter les recherches futures sur la dynamique du guidage, de la réception et de la double fécondation du tube pollinique.
Introduction
La génération d’une progéniture génétiquement unique dans les organismes à reproduction sexuée dépend de la fusion réussie des gamètes mâles et femelles. Chez les plantes à fleurs, l’interaction de deux gamètes mâles (spermatozoïdes) avec deux gamètes femelles (ovule et cellule centrale) lors de la double fécondation dépend de la libération de spermatozoïdes par le tube pollinique (le gamétophyte mâle). Ce processus, appelé réception du tube pollinique, est largement contrôlé par les cellules synergiques qui résident dans le sac embryonnaire (le gamétophyte femelle)1,2. Comme la réception du tube pollinique a lieu profondément à l’intérieur de la fleur, une méthode permettant l’imagerie du processus par cellules vivantes, appelée réception semi-in vitro (SIV), a été établie3. Avec cette méthode, les ovules d’Arabidopsis excisés sont placés sur un milieu de germination pollinique semi-liquide et ciblés par des tubes polliniques qui se développent à travers le stigmate et le style d’un pistil sectionné à la jonction du tractus transmettant le style 3,4. Depuis le développement de cette technique, des observations détaillées ont conduit à plusieurs découvertes concernant le guidage, la réception et la fécondation des tubes polliniques. Ces découvertes comprennent, entre autres, l’acquisition de la compétence de ciblage du tube pollinique par croissance à travers le stigmate3, l’apparition d’oscillations calciques intracellulaires dans les synergides à l’arrivée du tube pollinique 5,6,7,8,9, et la dynamique de libération et de fécondation des spermatozoïdes lors de l’éclatement du tube pollinique 10 . Néanmoins, parce que cette technique repose sur l’excision des ovules, les observations de fécondation sont limitées en nombre, et la réception des tubes polliniques est souvent aberrante, entraînant l’échec de la rupture du tube pollinique (Vidéo 1 et Fichier supplémentaire 1). Par conséquent, il est nécessaire d’adopter une approche plus efficace permettant des analyses à haut débit de la réception et de la fécondation des tubes polliniques.
Lors de l’élaboration de ce protocole, plusieurs nouvelles approches d’analyse de la réception du tube pollinique, allant des méthodes les plus « in vitro » aux plus « in vivo », ont été testées, et une technique efficace basée sur l’excision du septum entier a été mise au point, ce qui permet jusqu’à 40 observations de fécondation par jour. Ici, les nuances et les points critiques de la technique sont décrits, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et les paramètres d’imagerie. En suivant ce protocole, la recherche axée sur le guidage du tube pollinique, la réception du tube pollinique et la double fécondation devrait être facilitée. Les tailles d’échantillon plus élevées que la méthode permet devraient renforcer la solidité scientifique des conclusions tirées d’expériences d’imagerie en direct. Les applications potentielles de cette technique comprennent, sans toutefois s’y limiter, l’observation des changements moléculaires et physiologiques des concentrations de calcium cytosolique ([Ca2+]cyt), du pH ou de H 2 O2au cours des interactions entre gamétophytes grâce à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés. En outre, les changements cytologiques, tels que la dégénérescence de la synergie réceptive, la migration des spermatozoïdes ou la karyogamie, peuvent être plus facilement observés en utilisant cette méthode améliorée. Enfin, le calendrier des différentes étapes de la fécondation peut être surveillé en microscopie à grand champ, puis des analyses plus détaillées utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) ou la microscopie à excitation à deux photons (2PEM) peuvent être effectuées pour une résolution plus élevée et une reconstruction 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit présente un protocole efficace pour l’imagerie de la réception du tube pollinique et de la double fécondation chez Arabidopsis. La méthode améliorée, SIV cum septum, augmente considérablement le pourcentage et le nombre total d’événements de réception réussie du tube pollinique qui sont observables par séance d’imagerie. Les résultats représentatifs présentés ici démontrent une séance d’imagerie avec 41 événements de réception réussie du tube pollinique et 10 o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Sara Simonini et Stefano Bencivenga pour le don de la construction pFG:roGFP2-ORP1-NLS et Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter et Celia Baroux pour leurs conseils sur la microscopie. Nous remercions Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima et tous les autres participants à la Conférence internationale sur la reproduction sexuée des plantes 2022 qui ont manifesté leur intérêt pour un protocole sur le VIS cum septum. Ces travaux ont été soutenus par l’Université de Zurich et des subventions du Fonds national suisse à U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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