अर्ध-इन विट्रो कम सेप्टम विधि का उपयोग करके एराबिडोप्सिस पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन की लाइव इमेजिंग
Summary
यहां, हम एराबिडोप्सिस थैलियाना में पराग ट्यूब मार्गदर्शन और रिसेप्शन का अवलोकन करने के लिए सेमी-इन विट्रो (एसआईवी) विधि के सुधार का वर्णन करते हैं, जो अंडाणुओं की ग्रहणशीलता को बढ़ाता है। निषेचन की गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए उच्च-थ्रूपुट एसआईवी सह सेप्टम विधि को गैमेटोफाइट मार्कर लाइनों और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के साथ जोड़ा जा सकता है।
Abstract
फूलों के पौधों में, पिस्टिल के भीतर पराग ट्यूब (नर गैमेटोफाइट) की वृद्धि और मार्गदर्शन और मादा गैमेटोफाइट द्वारा पराग ट्यूब का रिसेप्शन डबल निषेचन और बाद में बीज विकास के लिए आवश्यक है। पराग ट्यूब रिसेप्शन के दौरान नर और मादा गैमेटोफाइट्स के बीच बातचीत पराग ट्यूब टूटने और दोहरे निषेचन को प्रभावित करने के लिए दो शुक्राणु कोशिकाओं की रिहाई में समाप्त होती है। चूंकि पराग ट्यूब विकास और डबल निषेचन फूल के ऊतकों के भीतर गहराई से छिपे हुए हैं, इस प्रक्रिया को विवो में देखना मुश्किल है।
मॉडल पौधे एराबिडोप्सिस थैलियाना में निषेचन की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक अर्ध-इन विट्रो (एसआईवी) विधि विकसित की गई है और कई जांचों में लागू की गई है। इन अध्ययनों ने फूलों के पौधों में निषेचन प्रक्रिया कैसे होती है और नर और मादा गैमेटोफाइट्स की बातचीत के दौरान कौन से सेलुलर और आणविक परिवर्तन होते हैं, इसकी मूलभूत विशेषताओं को स्पष्ट करने में मदद की है। हालांकि, क्योंकि इन लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों में व्यक्तिगत अंडाणुओं का छांटना शामिल है, वे प्रति इमेजिंग सत्र में कम संख्या में टिप्पणियों तक सीमित हैं, जिससे यह दृष्टिकोण थकाऊ और बहुत समय लेने वाला हो जाता है। अन्य तकनीकी कठिनाइयों के अलावा, विट्रो में अंडाणुओं को निषेचित करने के लिए पराग ट्यूबों की विफलता अक्सर रिपोर्ट की जाती है, जो इस तरह के विश्लेषणों को गंभीर रूप से भ्रमित करती है।
यहां, एक स्वचालित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से पराग ट्यूब रिसेप्शन और निषेचन की इमेजिंग के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिससे पराग ट्यूब रिसेप्शन और प्रति इमेजिंग सत्र टूटने के 40 अवलोकनों की अनुमति मिलती है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर और मार्कर लाइनों के उपयोग के साथ युग्मित, यह विधि कम समय निवेश के साथ बड़े नमूना आकारों की पीढ़ी को सक्षम बनाती है। फूलों के मंचन, विच्छेदन, मध्यम तैयारी और इमेजिंग सहित तकनीक की बारीकियों और महत्वपूर्ण बिंदुओं को स्पष्ट रूप से वीडियो प्रारूप में विस्तृत किया गया है ताकि पराग ट्यूब मार्गदर्शन, रिसेप्शन और डबल निषेचन की गतिशीलता पर भविष्य के शोध की सुविधा मिल सके।
Introduction
यौन प्रजनन करने वाले जीवों में आनुवंशिक रूप से अद्वितीय संतानों की पीढ़ी नर और मादा युग्मकों के सफल संलयन पर निर्भर है। फूलों के पौधों में, दोहरे निषेचन के दौरान दो मादा युग्मकों (अंडा कोशिका और केंद्रीय कोशिका) के साथ दो नर युग्मकों (शुक्राणु कोशिकाओं) की बातचीत पराग ट्यूब (पुरुष गैमेटोफाइट) से शुक्राणु रिलीज पर निर्भर करती है। यह प्रक्रिया, जिसे पराग ट्यूब रिसेप्शन कहा जाता है, काफी हद तक सिनर्जिड कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित होती है जो भ्रूण थैली (मादा गैमेटोफाइट) 1,2 के भीतर रहती हैं। चूंकि पराग ट्यूब रिसेप्शन फूल के अंदर गहराई से होता है, प्रक्रिया की लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देने वाली एक विधि, जिसे सेमी-इन विट्रो (एसआईवी) पराग ट्यूब रिसेप्शन कहा जाता है, स्थापित किया गया है। इस विधि के साथ, एराबिडोप्सिस डिंब्यूल्स को अर्ध-तरल पराग अंकुरण माध्यम पर रखा जाता है और पराग ट्यूबों द्वारा लक्षित किया जाता है जो शैली-संचारित पथ जंक्शन 3,4 पर अलग किए गए पिस्टिल के कलंक और शैली के माध्यम से बढ़ते हैं। इस तकनीक के विकास के बाद से, विस्तृत टिप्पणियों ने पराग ट्यूब मार्गदर्शन, रिसेप्शन और निषेचन के आसपास कई खोजों को जन्म दिया है। दूसरों के अलावा, इन खोजों में कलंक 3 के माध्यम से विकास द्वारा पराग ट्यूब लक्ष्यीकरण क्षमता का अधिग्रहण, पराग ट्यूब आगमन 5,6,7,8,9 पर सिनर्जिड्स में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम दोलनों की शुरुआत, और पराग ट्यूब फटने पर शुक्राणु कोशिका रिलीज और निषेचन की गतिशीलता10 शामिल है . फिर भी, क्योंकि यह तकनीक अंडाणुओं के छांटने पर निर्भर करती है, निषेचन के अवलोकन संख्या में सीमित होते हैं, और पराग ट्यूब रिसेप्शन अक्सर असामान्य होता है, जिसके परिणामस्वरूप पराग ट्यूब टूटने की विफलता होती है (वीडियो 1 और पूरक फ़ाइल 1)। इसलिए, पराग ट्यूब रिसेप्शन और निषेचन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एक अधिक कुशल दृष्टिकोण की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में, पराग ट्यूब रिसेप्शन का विश्लेषण करने के लिए कई नए दृष्टिकोण, जो सबसे “इन विट्रो” से लेकर सबसे “विवो” विधियों तक फैले हुए थे, का परीक्षण किया गया था, और पूरे सेप्टम के छांटने के आधार पर एक कुशल तकनीक पर फैसला किया गया था, जो प्रति दिन निषेचन के 40 अवलोकनों की अनुमति देता है। यहां, तकनीक की बारीकियों और महत्वपूर्ण बिंदुओं को रेखांकित किया गया है, जिसमें फूल मंचन, विच्छेदन, मध्यम तैयारी और इमेजिंग सेटिंग्स शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, पराग ट्यूब मार्गदर्शन, पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन पर ध्यान केंद्रित करने वाले अनुसंधान को सुविधाजनक बनाया जाना चाहिए। विधि के लिए उच्च नमूना आकार की अनुमति देता है, लाइव इमेजिंग प्रयोगों से निकाले गए निष्कर्षों की वैज्ञानिक सुदृढ़ता को बढ़ावा देने की उम्मीद है। इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के उपयोग के माध्यम से गैमेटोफाइट इंटरैक्शन के दौरान साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता ([सीए2 +]साइट), पीएच, या एच2ओ2 में आणविक और शारीरिक परिवर्तनों के अवलोकन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इसके अलावा, साइटोलॉजिकल परिवर्तन, जैसे कि ग्रहणशील सिनर्जिड का अध: पतन, शुक्राणु कोशिका प्रवास, या कैरियोगैमी, इस बेहतर विधि का उपयोग करके अधिक आसानी से देखा जा सकता है। अंत में, निषेचन के विभिन्न चरणों के समय की निगरानी वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत की जा सकती है, और फिर उच्च रिज़ॉल्यूशन और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) या दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी (2पीईएम) का उपयोग करके अधिक विस्तृत विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि एराबिडोप्सिस में पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन की इमेजिंग के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का परिचय देती है। बेहतर विधि, एसआईवी कम सेप्टम, सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन घटनाओं के प्रतिशत और ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सारा सिमोनिनी और स्टेफानो बेन्सिवेंगा को pFG: roGFP2-ORP1-NLS निर्माण दान करने के लिए और क्रिस्टोफ़ ईचेनबर्गर, जोहान अल्मेंडिंगर, विन्सेंट सटर और सेलिया बारोक्स को माइक्रोस्कोपी पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद देते हैं। हम कृपया रवि पलानिवेलु, फिलिप डेनिंगर, शेरोन केसलर, मार्क जॉनसन, तोमोकाजू कावाशिमा और यौन पौधे प्रजनन 2022 पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन में बाकी सभी की सलाह को स्वीकार करते हैं, जिन्होंने एसआईवी सह सेप्टम पर एक प्रोटोकॉल में रुचि दिखाई। इस काम को ज्यूरिख विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन से यू.जी.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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