Imaging dal vivo della ricezione del tubo di polline di Arabidopsis e doppia fecondazione utilizzando il metodo semi-in vitro del setto di cum
Summary
Qui, descriviamo un miglioramento del metodo semi-in vitro (SIV) per osservare la guida e la ricezione del tubo pollinico de Arabidopsis thaliana, che aumenta la ricettività degli ovuli. Il metodo SIV cum septum ad alta produttività può essere accoppiato con linee marcatrici di gametofiti e biosensori geneticamente codificati per monitorare il processo dinamico di fecondazione.
Abstract
Nelle piante da fiore, la crescita e la guida del tubo pollinico (gametofito maschile) all’interno del pistillo e la ricezione del tubo pollinico da parte del gametofito femminile sono essenziali per la doppia fecondazione e il successivo sviluppo del seme. Le interazioni tra gametofiti maschili e femminili durante la ricezione del tubo pollinico culminano nella rottura del tubo pollinico e nel rilascio di due spermatozoi per effettuare una doppia fecondazione. Poiché la crescita del tubo pollinico e la doppia fecondazione sono profondamente nascoste all’interno dei tessuti del fiore, questo processo è difficile da osservare in vivo.
Un metodo semi-in vitro (SIV) per l’imaging di cellule vive della fecondazione nella pianta modello Arabidopsis thaliana è stato sviluppato e implementato de diverse indagini. Questi studi hanno contribuito a chiarire le caratteristiche fondamentali di come avviene il processo di fecondazione nelle piante da fiore e quali cambiamenti cellulari e molecolari si verificano durante l’interazione dei gametofiti maschili e femminili. Tuttavia, poiché questi esperimenti di imaging di cellule vive comportano l’escissione di singoli ovuli, sono limitati a un basso numero di osservazioni per sessione di imaging, rendendo questo approccio noioso e molto dispendioso in termini di tempo. Tra le altre difficoltà tecniche, viene spesso segnalata un’incapacità dei tubi pollinici di fertilizzare gli ovuli in vitro, il che confonde gravemente tali analisi.
Qui viene fornito un protocollo video dettagliato per l’imaging della ricezione e della fecondazione del tubo pollinico in modo automatizzato e ad alta produttività, consentendo fino a 40 osservazioni della ricezione e della rottura del tubo pollinico per sessione di imaging. Abbinato all’uso di biosensori e linee di marcatori geneticamente codificati, questo metodo consente la generazione di campioni di grandi dimensioni con un investimento di tempo ridotto. Le sfumature e i punti critici della tecnica, tra cui la messa in scena dei fiori, la dissezione, la preparazione del mezzo e l’imaging, sono chiaramente dettagliati in formato video per facilitare la ricerca futura sulle dinamiche della guida, della ricezione e della doppia fecondazione del tubo pollinico.
Introduction
La generazione di prole geneticamente unica negli organismi che si riproducono sessualmente dipende dalla fusione riuscita di gameti maschili e femminili. Nelle piante da fiore, l’interazione di due gameti maschili (spermatozoi) con due gameti femminili (cellula uovo e cellula centrale) durante la doppia fecondazione dipende dal rilascio di spermatozoi dal tubo pollinico (il gametofito maschile). Questo processo, chiamato ricezione del tubo pollinico, è in gran parte controllato dalle cellule sinergiche che risiedono all’interno del sacco embrionale (il gametofito femminile)1,2. Poiché la ricezione del tubo pollinico avviene in profondità all’interno del fiore, è stato stabilito un metodo che consente l’imaging delle cellule vive del processo, chiamato ricezione del tubo pollinico semi-in vitro (SIV),3. Con questo metodo, gli ovuli di Arabidopsis asportati vengono posti su un mezzo di germinazione del polline semi-liquido e presi di mira da tubi pollinici che crescono attraverso lo stigma e lo stile di un pistillo reciso alla giunzione del tratto di trasmissione dello stile 3,4. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, osservazioni dettagliate hanno portato a diverse scoperte riguardanti la guida, la ricezione e la fecondazione del tubo pollinico. Tra le altre, queste scoperte includono l’acquisizione della competenza di targeting del tubo pollinico attraverso la crescita attraverso lo stigma3, l’inizio delle oscillazioni intracellulari del calcio nei sinergidi all’arrivo del tubo pollinico 5,6,7,8,9 e la dinamica del rilascio e della fecondazione delle cellule spermatiche allo scoppio del tubo pollinico10 . Tuttavia, poiché questa tecnica si basa sull’escissione degli ovuli, le osservazioni della fecondazione sono limitate in numero e la ricezione del tubo pollinico è spesso aberrante, con conseguente fallimento della rottura del tubo pollinico (Video 1 e File supplementare 1). Pertanto, vi è la necessità di un approccio più efficiente che consenta analisi ad alto rendimento della ricezione e della fecondazione del tubo pollinico.
Nello sviluppo di questo protocollo, sono stati testati diversi nuovi approcci per analizzare la ricezione del tubo pollinico, che vanno dai metodi più “in vitro” a quelli più “in vivo“, ed è stata stabilita una tecnica efficiente basata sull’escissione dell’intero setto, che consente fino a 40 osservazioni di fecondazione al giorno. Qui vengono delineate le sfumature e i punti critici della tecnica, tra cui la messa in scena dei fiori, la dissezione, la preparazione del mezzo e le impostazioni di imaging. Seguendo questo protocollo, la ricerca incentrata sulla guida del tubo pollinico, sulla ricezione del tubo pollinico e sulla doppia fecondazione dovrebbe essere facilitata. Le dimensioni del campione più elevate consentite dal metodo dovrebbero rafforzare la solidità scientifica delle conclusioni tratte dagli esperimenti di imaging dal vivo. Le potenziali applicazioni di questa tecnica includono, ma non sono limitate a, l’esecuzione di osservazioni dei cambiamenti molecolari e fisiologici nelle concentrazioni citosoliche di calcio ([Ca2+]cyt), pH o H 2 O2durante le interazioni gametofite attraverso l’uso di biosensori geneticamente codificati. Inoltre, i cambiamenti citologici, come la degenerazione del sinergico ricettivo, la migrazione delle cellule spermatiche o il karyogamy, possono essere osservati più facilmente utilizzando questo metodo migliorato. Infine, i tempi delle diverse fasi della fecondazione possono essere monitorati con microscopia a campo largo, e quindi analisi più dettagliate utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) o la microscopia di eccitazione a due fotoni (2PEM) possono essere condotte per una risoluzione più elevata e la ricostruzione 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto introduce un protocollo efficiente per l’imaging della ricezione del tubo pollinico e della doppia fecondazione in Arabidopsis. Il metodo migliorato, SIV cum septum, aumenta notevolmente la percentuale e il numero totale di eventi di ricezione del tubo pollinico osservabili con successo per sessione di imaging. I risultati rappresentativi mostrati qui dimostrano una sessione di imaging con 41 eventi di ricezione del tubo pollinico di successo e 10 ovuli che mostrano difetti di ricezio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sara Simonini e Stefano Bencivenga per aver donato il costrutto pFG:roGFP2-ORP1-NLS e Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter e Celia Baroux per i loro consigli sulla microscopia. Riconosciamo gentilmente i consigli di Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima e tutti gli altri alla Conferenza internazionale sulla riproduzione sessuale delle piante 2022 che hanno mostrato interesse per un protocollo su SIV cum septum. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Università di Zurigo e da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica a U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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