Arabidopsis Polen Tüpü Alımı ve Çift Döllenmenin Semi-In Vitro Cum Septum Yöntemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi
Summary
Burada, Arabidopsis thaliana’da polen tüpü rehberliğini ve alımını gözlemlemek için ovüllerin alıcılığını artıran yarı in vitro (SIV) yöntemin geliştirilmesini açıklıyoruz. Yüksek verimli SIV cum septum yöntemi, dinamik döllenme sürecini izlemek için gametofit işaretleyici çizgileri ve genetik olarak kodlanmış biyosensörlerle birleştirilebilir.
Abstract
Çiçekli bitkilerde, polen tüpünün (erkek gametofit) pistil içindeki büyümesi ve yönlendirilmesi ve polen tüpünün dişi gametofit tarafından alınması, çift döllenme ve sonraki tohum gelişimi için gereklidir. Polen tüpü alımı sırasında erkek ve dişi gametofitler arasındaki etkileşimler, polen tüpü rüptürü ve çift döllenmeyi etkilemek için iki sperm hücresinin salınması ile sonuçlanır. Polen tüpü büyümesi ve çift döllenme çiçeğin dokularında derinden gizlendiğinden, bu süreci in vivo olarak gözlemlemek zordur.
Arabidopsis thaliana model bitkisinde döllenmenin canlı hücre görüntülemesi için yarı in vitro (SIV) bir yöntem geliştirilmiş ve çeşitli araştırmalarda uygulanmıştır. Bu çalışmalar, çiçekli bitkilerde döllenme sürecinin nasıl gerçekleştiğinin ve erkek ve dişi gametofitlerin etkileşimi sırasında hangi hücresel ve moleküler değişikliklerin meydana geldiğinin temel özelliklerinin aydınlatılmasına yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, bu canlı hücre görüntüleme deneyleri bireysel ovüllerin eksizyonunu içerdiğinden, görüntüleme seansı başına düşük sayıda gözlemle sınırlıdır, bu da bu yaklaşımı sıkıcı ve çok zaman alıcı hale getirir. Diğer teknik zorlukların yanı sıra, polen tüplerinin ovülleri in vitro olarak döllemedeki başarısızlığı sıklıkla bildirilmektedir ve bu da bu tür analizleri ciddi şekilde karıştırmaktadır.
Burada, polen tüpü alımının ve döllenmesinin otomatik ve yüksek verimli bir şekilde görüntülenmesi için ayrıntılı bir video protokolü sağlanmıştır ve görüntüleme seansı başına 40 adede kadar polen tüpü alımı ve kopması gözlemine izin vermektedir. Genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin ve işaretleyici hatlarının kullanımı ile birleştiğinde, bu yöntem daha az zaman yatırımı ile büyük numune boyutlarının oluşturulmasını sağlar. Çiçek evreleme, diseksiyon, orta hazırlık ve görüntüleme dahil olmak üzere tekniğin nüansları ve kritik noktaları, polen tüpü rehberliği, alımı ve çift gübrelemenin dinamikleri hakkında gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak için video formatında açıkça detaylandırılmıştır.
Introduction
Cinsel olarak üreyen organizmalarda genetik olarak benzersiz yavruların oluşumu, erkek ve dişi gametlerin başarılı bir şekilde kaynaşmasına bağlıdır. Çiçekli bitkilerde, çift döllenme sırasında iki erkek gametin (sperm hücreleri) iki dişi gamet (yumurta hücresi ve merkezi hücre) ile etkileşimi, polen tüpünden (erkek gametofit) sperm salınımına bağlıdır. Polen tüpü alımı olarak adlandırılan bu süreç, büyük ölçüde embriyo kesesi (dişi gametofit) içinde bulunan sinergid hücreler tarafından kontrol edilir1,2. Polen tüpü alımı çiçeğin derinliklerinde gerçekleştiğinden, yarı in vitro (SIV) polen tüpü alımı adı verilen işlemin canlı hücre görüntülemesine izin veren bir yöntem oluşturulmuştur3. Bu yöntemle, eksize edilmiş Arabidopsis ovülleri yarı sıvı polen çimlenme ortamına yerleştirilir ve stil ileten trakt kavşağı 3,4’te kopmuş bir pistilin damgası ve stili ile büyüyen polen tüpleri tarafından hedeflenir. Bu tekniğin geliştirilmesinden bu yana, ayrıntılı gözlemler polen tüpü rehberliği, alımı ve gübrelemesini çevreleyen çeşitli keşiflere yol açmıştır. Diğerlerinin yanı sıra, bu keşifler arasında stigma3 yoluyla büyüme yoluyla polen tüpü hedefleme yetkinliğinin kazanılması, polen tüpügelişi 5,6,7,8,9 üzerine sinerjlerde hücre içi kalsiyum salınımlarının başlaması ve polen tüpü patlaması üzerine sperm hücresi salınımı ve döllenme dinamikleri10 bulunmaktadır . Bununla birlikte, bu teknik ovüllerin eksizyonuna dayandığından, döllenme gözlemleri sayıca sınırlıdır ve polen tüpü alımı genellikle anormaldir ve polen tüpü rüptürünün başarısızlığına neden olur (Video 1 ve Ek Dosya 1). Bu nedenle, polen tüpü alımı ve gübrelemesinin yüksek verimli analizlerine izin veren daha verimli bir yaklaşıma ihtiyaç vardır.
Bu protokolün geliştirilmesinde, polen tüpü alımını analiz etmek için en “in vitro” yöntemlerden en “in vivo” yöntemlere kadar uzanan birkaç yeni yaklaşım test edildi ve günde 40 adede kadar döllenme gözlemine izin veren tüm septumun eksizyonuna dayanan etkili bir teknik üzerinde duruldu. Burada, çiçek evreleme, diseksiyon, orta hazırlık ve görüntüleme ayarları dahil olmak üzere tekniğin nüansları ve kritik noktaları özetlenmiştir. Bu protokolü izleyerek, polen tüpü rehberliği, polen tüpü alımı ve çift döllenmeye odaklanan araştırmalar kolaylaştırılmalıdır. Yöntemin izin verdiği daha yüksek örneklem boyutlarının, canlı görüntüleme deneylerinden elde edilen sonuçların bilimsel sağlamlığını desteklemesi beklenmektedir. Bu tekniğin potansiyel uygulamaları, genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin kullanımı yoluyla gametofit etkileşimleri sırasında sitozolik kalsiyum konsantrasyonlarındaki ([Ca2 +] sit), pH veya H2O2’dekimoleküler ve fizyolojik değişikliklerin gözlemlerini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, alıcı sinerjinin dejenerasyonu, sperm hücresi göçü veya karyogami gibi sitolojik değişiklikler, bu gelişmiş yöntem kullanılarak daha kolay gözlemlenebilir. Son olarak, döllenmenin farklı aşamalarının zamanlaması geniş alan mikroskobu altında izlenebilir ve daha sonra daha yüksek çözünürlük ve 3D rekonstrüksiyon için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) veya iki foton uyarma mikroskobu (2PEM) kullanılarak daha ayrıntılı analizler yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazı, Arabidopsis’te polen tüpü alımı ve çift döllenmenin görüntülenmesinde etkili bir protokol sunmaktadır. Geliştirilmiş yöntem olan SIV cum septum, görüntüleme seansı başına gözlemlenebilen başarılı polen tüpü alım olaylarının yüzdesini ve toplam sayısını büyük ölçüde artırır. Burada gösterilen temsili sonuçlar, 41 başarılı polen tüpü alım olayı ve alım kusurları gösteren 10 ovül (~% 80 verimlilik) içeren bir görüntüleme seansını gösterme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sara Simonini ve Stefano Bencivenga’ya pFG:roGFP2-ORP1-NLS yapısını bağışladıkları için ve Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter ve Celia Baroux’ya mikroskopi konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima ve Uluslararası Cinsel Bitki Üreme Konferansı 2022’de SIV cum septum ile ilgili bir protokole ilgi gösteren herkesin tavsiyelerini kabul ediyoruz. Bu çalışma Zürih Üniversitesi tarafından desteklendi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı’ndan ABD’ye hibe edildi.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
