نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.
Abstract
جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.
Introduction
جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية1. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبيةللجلوكاجون 2،3،4. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية5،6،7. لذلك ، فإن توضيح مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تتوسط إفراز هرمون الجزيرة أمر ضروري لفهم الآليات الفسيولوجية والمرضية في جزر البنكرياس.
تمثل العمارة الكروية للجزر بعض العقبات أمام التجريب. وتشمل هذه التحديات اختلاف حجم الجزيرة وطبيعة 3D للجزر ، مما يقلل من نقل الفيروس داخل قلب الجزيرة 8,9. للتغلب على هذه التحديات ، تم تطوير نظام الجزر الزائفة ، حيث يتم تشتيت الجزر البشرية الأولية في خلايا مفردة ، وتحويلها بشكل غدي مع تركيبات ترميز الأهداف ذات الأهمية ، وإعادة تجميعها لتشكيل هياكل تشبه الجزر يتم التحكم فيها بالحجم تسمى الجزر الزائفة7. بالمقارنة مع الجزر الأصلية من نفس المتبرع التي تم استزراعها بالتوازي ، فإن هذه الجزر الزائفة متشابهة في التشكل وتكوين خلايا الغدد الصماء وإفراز الهرمونات7. تسمح هذه الطريقة بالتعبير عن التركيبات في جميع أنحاء الجزيرة الكاذبة ، مما يعني أنها تتغلب على حاجز سابق أمام التلاعب الجيني الموحد للجزر البشرية الأولية7،8،9.
في هذا البروتوكول ، تم دمج نظام الجزر الكاذبة مع جهاز الموائع الدقيقة للتعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية في خلايا الجزيرة البشرية الأولية والحصول على دقة زمنية لإفراز هرمون الجزيرة الكاذبة أثناء الانتشار الديناميكي10،11،12. يتم وضع الجزر الكاذبة في رقاقة دقيقة وتعريضها لتدفق مستمر من الإفرازات المختلفة عبر مضخة تمعجية12. تحتوي الرقاقة الدقيقة على قاع زجاجي شفاف ويتم تركيبها على مجهر متحد البؤر لتسجيل ديناميكيات الإشارات داخل الخلايا عبر التغيرات في شدة مضان المستشعر الحيوي. تتم مزامنة تصوير المستشعر الحيوي مع مجموعة النفايات السائلة الدقيقة للتحليل اللاحق لإفراز الأنسولين والجلوكاجون7. بالمقارنة مع macroperifusion ، يسمح نهج microperifusion هذا باستخدام عدد أقل من الجزر الكاذبة بسبب الحجم الأصغر لجهاز الموائع الدقيقة مقارنة بغرفة macroperifusion7.
لتسخير فائدة هذا النظام ، تم التعبير عن كاشف فرق الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري (cAMP) في المستشعر الحيوي في الموقع (cADDis) في الجزر الكاذبة البشرية لتقييم ديناميكيات cAMP وإفراز الهرمونات . يتكون المستشعر الحيوي cADDis من بروتين فلوري أخضر دائري (cpGFP) يتم وضعه في منطقة المفصلة لبروتين التبادل الذي يتم تنشيطه بواسطة cAMP 2 (EPAC2) ، ويربط مناطقه التنظيمية والحفازة. يؤدي ارتباط cAMP بالمنطقة التنظيمية ل EPAC2 إلى حدوث تغيير توافقي في منطقة المفصلة يزيد من التألق من cpGFP13. تستنبط الرسل داخل الخلايا مثل cAMP إفراز الأنسولين والجلوكاجون بعد التنشيط الأولي للمستقبلات المقترنة بالبروتين G14. يساعد تصوير الخلايا الحية إلى جانب microperifusion على ربط ديناميكيات cAMP داخل الخلايا بإفراز هرمون الجزيرة. على وجه التحديد ، في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء الجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis لمراقبة استجابات cAMP في خلايا ألفا وبيتا للمحفزات المختلفة: انخفاض الجلوكوز (2 mM الجلوكوز. G 2) ، ارتفاع الجلوكوز بالإضافة إلى إيزوبوتيل ميثيل زانثين (IBMX ؛ 20 مللي متر جلوكوز + 100 ميكرومتر IBMX ؛ G 20 + IBMX) ، وانخفاض الجلوكوز بالإضافة إلى الأدرينالين (Epi ؛ 2 mM الجلوكوز + 1 μM Epi ؛ G 2 + Epi). يسمح سير عمل العلاج هذا بتقييم ديناميكيات cAMP داخل الخلايا مباشرة عبر 1) تثبيط الفوسفوديستراز بوساطة IBMX ، والذي يعزز مستويات cAMP داخل الخلايا عن طريق منع تدهوره ، و 2) الأدرينالين ، وهو محفز معروف يعتمد على cAMP لإفراز الجلوكاجون في خلايا ألفا بوساطة تنشيط مستقبلات β الأدرينالية. فيما يلي تفاصيل خطوات إعداد جهاز microperifusion لتجارب تصوير الخلايا الحية ، وتحميل الجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة ، والتصوير المتزامن للخلايا الحية و microperifusion ، وتحليل آثار المستشعر الحيوي وإفراز الهرمونات بواسطة فحوصات الهرمونات القائمة على الصفيحة الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تقدير المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم لتبرعاتهم التي لا تقدر بثمن ، ويتم الاعتراف بالمعهد الدولي لمنظمات شراء الأعضاء ، وتقدم الطب (IIAM) والتبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI) لشراكتهم في جعل أنسجة البنكرياس البشرية متاحة للبحث. تم دعم هذا العمل من قبل شبكة أبحاث الجزر البشرية (RRID: SCR_014393) ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري (RRID: SCR_016202) ، DK106755 ، DK123716 ، DK123743 ، DK120456 ، DK104211 ، DK108120 ، DK112232 ، DK117147 ، DK112217 ، EY032442 ، و DK20593 (مركز فاندربيلت لأبحاث وتدريب مرض السكري) ، صندوق ليونا إم وهاري بي هيلمسلي الخيري ، JDRF ، وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية (BX000666) ، NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007347) ، F30DK134041 ، F30DK118830 ، وزمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
