Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.
Abstract
Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, bei denen es sich um kleine 3D-Ansammlungen spezialisierter endokriner und unterstützender Zellen handelt, die in der gesamten Bauchspeicheldrüse verstreut sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Glukosehomöostase durch die Sekretion von Insulin durch Betazellen, was den Blutzucker senkt, und von Glukagon durch Alphazellen, das den Blutzucker erhöht. Intrazelluläre Signalwege, einschließlich derer, die durch cAMP vermittelt werden, sind der Schlüssel für die regulierte Alpha- und Betazell-Hormonsekretion. Die 3D-Inselstruktur ist zwar essentiell für die koordinierte Inselfunktion, stellt aber experimentelle Herausforderungen für mechanistische Studien der intrazellulären Signalwege in primären menschlichen Inselzellen dar. Um diese Herausforderungen und Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine integrierte Live-Cell-Imaging- und Mikrofluidik-Plattform, die primäre menschliche Pseudoinseln verwendet, die von Spendern ohne Diabetes erzeugt wurden und in ihrer Morphologie, Zusammensetzung und Funktion nativen Inseln ähneln. Diese Pseudoinseln werden durch den Dispersions- und Reaggregationsprozess primärer humaner Inselzellen größengesteuert. Im dispergierten Zustand kann die Genexpression von Inselzellen manipuliert werden; So können beispielsweise Biosensoren wie der genetisch kodierte cAMP-Biosensor, cADDis, eingeführt werden. Nach ihrer Bildung ermöglichen Pseudoinseln, die einen genetisch kodierten Biosensor exprimieren, in Kombination mit konfokaler Mikroskopie und einer Mikroperifusionsplattform die synchrone Bewertung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und der sekretorischen Profile von Alpha- und Betazellhormonen, um einen besseren Einblick in zelluläre Prozesse und Funktionen zu erhalten.
Introduction
Die Langerhans-Inseln sind Mini-Organe, die über die gesamte Bauchspeicheldrüse verstreut sind und deren Funktion für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase entscheidend ist. Insulin wird aus Betazellen nach dem Metabolismus von Glukose, einem Anstieg des ATP/ADP-Verhältnisses, dem Verschluss von ATP-empfindlichen Kaliumkanälen, der Depolarisation der Plasmamembran und dem Einstrom von extrazellulärem Kalzium1 sezerniert. Die Glucagon-Sekretion aus Alpha-Zellen ist weniger verstanden, aber es wurde postuliert, dass intrazelluläre und parakrine Signalwege zur Exozytose des Glucagon-Granula-Granulats beitragen 2,3,4. Sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes sind mit einer Inselzelldysfunktion assoziiert 5,6,7. Daher ist die Aufklärung der intrazellulären Signalwege, die die Hormonsekretion von Inselzellen vermitteln, für das Verständnis physiologischer und pathologischer Mechanismen in Pankreasinseln unerlässlich.
Die kugelförmige Architektur von Inselchen stellt gewisse Hindernisse für Experimente dar. Zu diesen Herausforderungen gehören die Variation der Inselgröße und die 3D-Natur der Inseln, die die virale Transduktion innerhalb des Inselkerns reduziert 8,9. Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde ein Pseudoinselsystem entwickelt, in dem primäre menschliche Inseln in einzelne Zellen zerstreut, adenoviral mit Konstrukten transduziert werden, die für Ziele von Interesse kodieren, und reaggregiert werden, um größenkontrollierte, inselartige Strukturen zu bilden, die als Pseudoinseln bezeichnet werden7. Im Vergleich zu nativen Inseln desselben Spenders, die parallel kultiviert wurden, ähneln sich diese Pseudoinseln in Morphologie, endokriner Zellzusammensetzung und Hormonsekretion7. Diese Methode ermöglicht die Expression von Konstrukten in der gesamten Pseudoinsel, was bedeutet, dass sie eine frühere Barriere für die einheitliche genetische Manipulation primärer menschlicher Inseln überwindet 7,8,9.
In diesem Protokoll ist das Pseudoinselsystem mit einem mikrofluidischen Gerät integriert, um Biosensoren in primären menschlichen Inselzellen zu exprimieren und eine zeitliche Auflösung der Pseudoislet-Hormonsekretion während der dynamischen Perifusion zu erreichen10,11,12. Die Pseudoinseln werden in einen Mikrochip gelegt und über eine Peristaltikpumpe12 einem stetigen Strom verschiedener Sekretagogen ausgesetzt. Der Mikrochip hat einen transparenten Glasboden und ist auf einem konfokalen Mikroskop montiert, um die intrazelluläre Signaldynamik über Änderungen der Fluoreszenzintensität des Biosensors aufzuzeichnen. Die Biosensor-Bildgebung wird mit der Entnahme von Mikroperifusionsabwässern für die anschließende Analyse der Insulin- und Glukagonsekretion synchronisiert7. Im Vergleich zur Makroperifusion ermöglicht dieser Mikroperifusionsansatz aufgrund des geringeren Volumens der mikrofluidischen Vorrichtung im Vergleich zur Makroperifusionskammer7 die Verwendung von weniger Pseudoinseln.
Um den Nutzen dieses Systems zu nutzen, wurde der zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP)-Differenzdetektor (cADDis) in menschlichen Pseudoinseln exprimiert, um die cAMP-Dynamik und die Hormonsekretion zu beurteilen. Der cADDis-Biosensor besteht aus einem zirkulär permutierten grün fluoreszierenden Protein (cpGFP), das in der Scharnierregion eines durch cAMP2 (EPAC2) aktivierten Austauschproteins positioniert ist und dessen regulatorische und katalytische Regionen miteinander verbindet. Die Bindung von cAMP an die regulatorische Region von EPAC2 führt zu einer Konformationsänderung in der Scharnierregion, die die Fluoreszenz des cpGFP13 erhöht. Intrazelluläre Botenstoffe wie cAMP lösen nach der vorgeschalteten Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Insulin- und Glukagonsekretion aus14. Lebendzell-Bildgebung in Verbindung mit Mikroperifusion hilft, die intrazelluläre cAMP-Dynamik mit der Inselhormonsekretion zu verbinden. Konkret werden in diesem Protokoll cADDis-exprimierende Pseudoinseln erzeugt, um die cAMP-Reaktionen in Alpha- und Betazellen auf verschiedene Stimuli zu überwachen: niedrige Glukose (2 mM Glukose; G 2), hohe Glukose plus Isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM Glukose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) und niedrige Glukose plus Epinephrin (Epi; 2 mM Glukose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Dieser Behandlungsablauf ermöglicht die Beurteilung der intrazellulären cAMP-Dynamik direkt über 1) IBMX-vermittelte Phosphodiesterase-Hemmung, die den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht, indem sie deren Abbau verhindert, und 2) Epinephrin, ein bekannter cAMP-abhängiger Stimulator der Alphazell-Glukagonsekretion, der durch β-adrenerge Rezeptoraktivierung vermittelt wird. Die Schritte zum Aufbau des Mikroperifusionsapparates für Lebendzell-Imaging-Experimente, das Laden der Pseudoinseln in den Mikrochip, die synchrone Lebendzell-Bildgebung und Mikroperifusion sowie die Analyse der Biosensorspuren und der Hormonsekretion durch Mikrotiterplatten-basierte Hormon-Assays werden im Folgenden beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Integration eines Mikroperifusionssystems, biosensorexprimierender Pseudoinseln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie ermöglicht die synchrone Beurteilung intrazellulärer Signalereignisse und dynamischer Hormonsekretionsprofile. Das dynamische Mikroperifusionssystem kann eine Reihe von genau definierten Stimuli an die Pseudoinseln abgeben und ermöglicht die Sammlung des Abwassers, in dem die Insulin- und Glukagonkonzentrationen mit einem kommerziell erhältlichen ELISA gemessen werden können. Gleichzeitig erf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Organspender und ihre Familien werden für ihre unschätzbaren Spenden geschätzt, und das International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) und der National Disease Research Exchange (NDRI) werden für ihre Partnerschaft bei der Zugänglichmachung von menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe für die Forschung gewürdigt. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), dem Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 und DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), dem Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, dem U.S. Department of Veterans Affairs (BX000666), das NIGMS der National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 und das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
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