Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l’acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.
Abstract
Le isole pancreatiche di Langerhans, che sono piccole raccolte 3D di cellule endocrine e di supporto specializzate sparse in tutto il pancreas, hanno un ruolo centrale nel controllo dell’omeostasi del glucosio attraverso la secrezione di insulina da parte delle cellule beta, che abbassa la glicemia, e glucagone da parte delle cellule alfa, che aumenta la glicemia. Le vie di segnalazione intracellulare, comprese quelle mediate dal cAMP, sono fondamentali per la secrezione ormonale delle cellule alfa e beta regolata. La struttura delle isole 3D, sebbene essenziale per la funzione coordinata delle isole, presenta sfide sperimentali per gli studi meccanicistici delle vie di segnalazione intracellulare nelle cellule insulari umane primarie. Per superare queste sfide e limitazioni, questo protocollo descrive una piattaforma integrata di imaging per cellule vive e microfluidica che utilizza pseudoisole umane primarie generate da donatori senza diabete che assomigliano alle isole native nella loro morfologia, composizione e funzione. Queste pseudoisole sono di dimensioni controllate attraverso il processo di dispersione e riaggregazione delle cellule insulari umane primarie. Allo stato disperso, l’espressione genica delle cellule insulari può essere manipolata; ad esempio, possono essere introdotti biosensori come il biosensore cAMP geneticamente codificato, cADDis. Una volta formate, le pseudoisole che esprimono un biosensore geneticamente codificato, in combinazione con la microscopia confocale e una piattaforma di microperifusione, consentono la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali delle cellule alfa e beta per fornire maggiori informazioni sui processi e sulla funzione cellulare.
Introduction
Le isole di Langerhans sono mini organi sparsi in tutto il pancreas la cui funzione è cruciale per il mantenimento dell’omeostasi del glucosio. L’insulina viene secreta dalle cellule beta in seguito al metabolismo del glucosio, all’aumento del rapporto ATP/ADP, alla chiusura dei canali del potassio sensibili all’ATP, alla depolarizzazione della membrana plasmatica e all’afflusso di calcio extracellulare1. La secrezione di glucagone da parte delle cellule alfa è meno compresa, ma è stato ipotizzato che le vie intracellulari e paracrine contribuiscano all’esocitosidei granuli di glucagone 2,3,4. Sia il diabete di tipo 1 che quello di tipo 2 sono associati alla disfunzione delle cellule insulari 5,6,7. Pertanto, chiarire le vie di segnalazione intracellulare che mediano la secrezione dell’ormone insulare è essenziale per comprendere i meccanismi fisiologici e patologici nelle isole pancreatiche.
L’architettura sferica degli isolotti presenta alcuni ostacoli alla sperimentazione. Queste sfide includono la variazione delle dimensioni delle isole e la natura 3D degli isolotti, che riduce la trasduzione virale all’interno del nucleo dell’isolotto 8,9. Per superare queste sfide, è stato sviluppato un sistema di pseudoisole, in cui le isole umane primarie sono disperse in singole cellule, trasdotte adenoviralmente con costrutti che codificano i bersagli di interesse e riaggregate per formare strutture simili a isole di dimensioni controllate, denominate pseudoisole7. Rispetto alle isole native dello stesso donatore che sono state coltivate in parallelo, queste pseudoisole sono simili nella morfologia, nella composizione delle cellule endocrine e nella secrezione ormonale7. Questo metodo consente l’espressione di costrutti in tutto lo pseudoisolotto, il che significa che supera una precedente barriera alla manipolazione genetica uniforme delle isole umane primarie 7,8,9.
In questo protocollo, il sistema delle pseudoisole è integrato con un dispositivo microfluidico per esprimere i biosensori nelle cellule insulari umane primarie e ottenere la risoluzione temporale della secrezione dell’ormone delle pseudoisole durante la perifusione dinamica10,11,12. Le pseudoisole vengono inserite in un microchip ed esposte a un flusso costante di diversi secretagoghi tramite una pompa peristaltica12. Il microchip ha un fondo in vetro trasparente ed è montato su un microscopio confocale per registrare le dinamiche di segnalazione intracellulare attraverso le variazioni dell’intensità di fluorescenza del biosensore. L’imaging con biosensore è sincronizzato con la raccolta dell’effluente di microperifusione per la successiva analisi della secrezione di insulina e glucagone7. Rispetto alla macroperifusione, questo approccio di microperifusione consente di utilizzare un minor numero di pseudoisole a causa del volume inferiore del dispositivo microfluidico rispetto alla camera di macroperifusione7.
Per sfruttare l’utilità di questo sistema, il biosensore del rivelatore di differenza di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) in situ (cADDis) è stato espresso de pseudoisole umane per valutare la dinamica del cAMP e la secrezione ormonale. Il biosensore cADDis è composto da una proteina fluorescente verde permutata circolarmente (cpGFP) posizionata nella regione cerniera di una proteina di scambio attivata da cAMP 2 (EPAC2), collegando le sue regioni regolatorie e catalitiche. Il legame del cAMP alla regione regolatoria di EPAC2 provoca un cambiamento conformazionale nella regione cerniera che aumenta la fluorescenza dal cpGFP13. I messaggeri intracellulari come il cAMP suscitano la secrezione di insulina e glucagone dopo l’attivazione a monte dei recettori accoppiati a proteine G14. L’imaging di cellule vive abbinato alla microperifusione aiuta a collegare la dinamica intracellulare del cAMP con la secrezione dell’ormone insulare. In particolare, in questo protocollo, vengono generate pseudoisole che esprimono cADDis per monitorare le risposte di cAMP nelle cellule alfa e beta a vari stimoli: basso livello di glucosio (2 mM di glucosio; G 2), glucosio alto più isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM di glucosio + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) e basso contenuto di glucosio più adrenalina (Epi; 2 mM di glucosio + 1 μM di Epi; G 2 + Epi). Questo flusso di lavoro di trattamento consente la valutazione della dinamica intracellulare del cAMP direttamente tramite 1) l’inibizione della fosfodiesterasi mediata da IBMX, che migliora i livelli intracellulari di cAMP prevenendone la degradazione, e 2) l’epinefrina, un noto stimolatore cAMP-dipendente della secrezione di glucagone delle cellule alfa mediata dall’attivazione del recettore β-adrenergico. Di seguito sono descritti in dettaglio i passaggi per la configurazione dell’apparato di microperifusione per esperimenti di imaging su cellule vive, il caricamento delle pseudoisole nel microchip, l’imaging sincrono di cellule vive e la microperifusione e l’analisi delle tracce del biosensore e della secrezione ormonale mediante saggi ormonali basati su micropiastre.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’integrazione di un sistema di microperifusione, di pseudoisolette che esprimono biosensori e di microscopia confocale a scansione laser consente la valutazione sincrona degli eventi di segnalazione intracellulare e dei profili dinamici della secrezione ormonale. Il sistema dinamico di microperifusione è in grado di fornire una serie di stimoli ben definiti alle pseudoisole e consente la raccolta dell’effluente, in cui le concentrazioni di insulina e glucagone possono essere misurate mediante ELISA disponibile in comme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I donatori di organi e le loro famiglie sono apprezzati per le loro inestimabili donazioni, e l’International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) e il National Disease Research Exchange (NDRI) sono riconosciuti per la loro collaborazione nel rendere il tessuto pancreatico umano accessibile per la ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Rete di Ricerca sulle Isole Umane (RRID:SCR_014393), dal Programma di Analisi del Pancreas Umano (RRID:SCR_016202), dalla DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 e DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), The Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, il Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti (BX000666), il NIGMS del National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 e la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
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