Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi
Summary
Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.
Abstract
Pankreas boyunca serpiştirilmiş özel endokrin ve destekleyici hücrelerin küçük 3D koleksiyonları olan Langerhans’ın pankreas adacıkları, kan şekerini düşüren beta hücreleri tarafından insülin salgılanması yoluyla glikoz homeostazının kontrolünde merkezi bir role sahiptir ve glukagon, kan şekerini yükselten alfa hücreleri tarafından. cAMP’nin aracılık ettiği hücreler de dahil olmak üzere hücre içi sinyal yolları, düzenlenmiş alfa ve beta hücre hormonu sekresyonu için anahtardır. 3D adacık yapısı, koordineli adacık işlevi için gerekli olmakla birlikte, birincil insan adacık hücrelerinde hücre içi sinyal yollarının mekanik çalışmaları için deneysel zorluklar sunar. Bu zorlukların ve sınırlamaların üstesinden gelmek için bu protokol, morfolojileri, bileşimleri ve işlevleri bakımından doğal adacıklara benzeyen, diyabeti olmayan donörlerden üretilen birincil insan psödoisletlerini kullanan entegre bir canlı hücre görüntüleme ve mikroakışkan platformunu tanımlar. Bu psödoadacıklar, birincil insan adacık hücrelerinin dağılma ve yeniden toplanma süreci yoluyla boyut kontrollüdür. Dağınık durumda, adacık hücresi gen ekspresyonu manipüle edilebilir; örneğin, genetik olarak kodlanmış cAMP biyosensörü, cADDis gibi biyosensörler tanıtılabilir. Bir kez oluşturulduktan sonra, genetik olarak kodlanmış bir biyosensörü ifade eden psödo-adacıklar, konfokal mikroskopi ve bir mikroperifüzyon platformu ile birlikte, hücresel süreçler ve işlev hakkında daha fazla bilgi sağlamak için floresan biyosensör dinamiklerinin ve alfa ve beta hücre hormonu salgı profillerinin eşzamanlı değerlendirmesine izin verir.
Introduction
Langerhans adacıkları, işlevi glikoz homeostazının sürdürülmesi için çok önemli olan pankreas boyunca dağılmış mini organlardır. İnsülin, glikoz metabolizmasını, ATP/ADP oranındaki artışı, ATP’ye duyarlı potasyum kanallarının kapanmasını, plazma zarının depolarizasyonunu ve hücre dışı kalsiyum1 akışını takiben beta hücrelerinden salgılanır. Alfa hücrelerinden glukagon sekresyonu daha az anlaşılmıştır, ancak hücre içi ve parakrin yolların glukagon granül ekzositozunakatkıda bulunduğu varsayılmıştır 2,3,4. Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet, adacık hücresi disfonksiyonu ile ilişkilidir 5,6,7. Bu nedenle, pankreas adacıklarında adacık hormonu sekresyonuna aracılık eden hücre içi sinyal yolaklarının aydınlatılması, fizyolojik ve patolojik mekanizmaların anlaşılması için gereklidir.
Adacıkların küresel mimarisi, deney için bazı engeller sunar. Bu zorluklar arasında adacık boyutu varyasyonu ve adacıkların 3 boyutlu doğası yer alır, bu da adacık çekirdeği 8,9 içindeki viral iletimi azaltır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil insan adacıklarının tek hücrelere dağıldığı, ilgilenilen hedefleri kodlayan yapılarla adenoviral olarak dönüştürüldüğü ve psödoadacıklar7 olarak adlandırılan boyut kontrollü, adacık benzeri yapılar oluşturmak üzere yeniden toplandığı bir psödoislet sistemi geliştirilmiştir. Paralel olarak kültürlenen aynı donörden alınan doğal adacıklarla karşılaştırıldığında, bu psödoadacıklar morfoloji, endokrin hücre bileşimi ve hormon sekresyonu bakımından benzerdir7. Bu yöntem, psödoadacık boyunca yapıların ifadesine izin verir, yani birincil insan adacıklarının tek tip genetik manipülasyonunakarşı önceki bir engelin üstesinden gelir 7,8,9.
Bu protokolde, psödoislet sistemi, primer insan adacık hücrelerinde biyosensörleri eksprese etmek ve dinamik perifüzyon sırasında psödoislet hormonu sekresyonunun zamansal çözünürlüğünü kazanmak için bir mikroakışkan cihaz ile entegre edilmiştir10,11,12. Psödoadacıklar bir mikroçip içine yerleştirilir ve peristaltik bir pompa12 aracılığıyla farklı sekretagogların sabit akışına maruz bırakılır. Mikroçip şeffaf bir cam tabana sahiptir ve biyosensör floresan yoğunluğundaki değişiklikler yoluyla hücre içi sinyal dinamiklerini kaydetmek için konfokal bir mikroskop üzerine monte edilmiştir. Biyosensör görüntüleme, insülin ve glukagon sekresyonunun müteakip analizi için mikroperifüzyon atık suyunun toplanmasıyla senkronize edilir7. Makroperifüzyon ile karşılaştırıldığında, bu mikroperifüzyon yaklaşımı, makroperifüzyon odasına kıyasla mikroakışkan cihazın daha küçük hacmi nedeniyle daha az psödoadacık kullanılmasına izin verir7.
Bu sistemin faydasından yararlanmak için, cAMP dinamiklerini ve hormon sekresyonunu değerlendirmek için insan psödoisletlerinde siklik adenozin monofosfat (cAMP) fark dedektörü in situ (cADDis) biyosensörü eksprese edildi. cADDis biyosensörü, düzenleyici ve katalitik bölgelerini birbirine bağlayan, cAMP 2 (EPAC2) tarafından aktive edilen bir değişim proteininin menteşe bölgesine yerleştirilmiş dairesel olarak permütasyonlu bir yeşil floresan proteinden (cpGFP) oluşur. cAMP’nin EPAC2’nin düzenleyici bölgesine bağlanması, menteşe bölgesinde cpGFP13’ten floresansı artıran konformasyonel bir değişiklik ortaya çıkarır. cAMP gibi hücre içi haberciler, G-proteinine bağlı reseptörlerin yukarı akış aktivasyonundan sonra insülin ve glukagon sekresyonunu ortaya çıkarır14. Mikroperifüzyon ile birleştirilmiş canlı hücre görüntüleme, hücre içi cAMP dinamiklerini adacık hormonu sekresyonu ile ilişkilendirmeye yardımcı olur. Spesifik olarak, bu protokolde, alfa ve beta hücrelerinde çeşitli uyaranlara cAMP yanıtlarını izlemek için cADDis eksprese eden psödoisletler üretilir: düşük glikoz (2 mM glikoz; G 2), yüksek glikoz artı izobütilmetilksantin (IBMX; 20 mM glikoz + 100 μM IBMX; G20 + IBMX) ve düşük glukoz artı epinefrin (Epi; 2 mM glukoz + 1 μM Epi; G2 + Epi). Bu tedavi iş akışı, hücre içi cAMP dinamiklerinin doğrudan 1) bozulmasını önleyerek hücre içi cAMP seviyelerini artıran IBMX aracılı fosfodiesteraz inhibisyonu ve 2) β-adrenerjik reseptör aktivasyonunun aracılık ettiği alfa hücresi glukagon sekresyonunun bilinen bir cAMP’ye bağlı uyarıcısı olan epinefrin aracılığıyla değerlendirilmesine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme deneyleri için mikroperifüzyon aparatının kurulması, psödoisletlerin mikroçipe yüklenmesi, senkron canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon ve mikroplaka bazlı hormon tahlilleri ile biyosensör izlerinin ve hormon sekresyonunun analizi için adımlar aşağıda detaylandırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir mikroperifüzyon sisteminin, biyosensör eksprese eden psödoadacıkların ve lazer taramalı konfokal mikroskopinin entegrasyonu, hücre içi sinyal olaylarının ve dinamik hormon salgı profillerinin senkronize değerlendirmesine izin verir. Dinamik mikroperifüzyon sistemi, psödoisletlere bir dizi iyi tanımlanmış uyaran iletebilir ve insülin ve glukagon konsantrasyonlarının ticari olarak temin edilebilen ELISA ile ölçülebildiği atık suyun toplanmasına izin verir. Aynı zamanda, bir konfokal mikroskop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Organ bağışçıları ve aileleri paha biçilmez bağışları için takdir edilmektedir ve Uluslararası Organ Tedarik Organizasyonları Enstitüsü, Tıbbın İlerlemesi (IIAM) ve Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi (NDRI), insan pankreas dokusunu araştırma için erişilebilir hale getirme konusundaki ortaklıkları için kabul edilmektedir. Bu çalışma, İnsan Adacık Araştırma Ağı (RRID:SCR_014393), İnsan Pankreas Analiz Programı (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ve DK20593 (Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi), Leona M. ve Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, ABD Gazi İşleri Bakanlığı (BX000666), Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu (1937963) NIGMS.
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
