用于同步评估荧光生物传感器动力学和激素分泌谱的人假胰岛系统
Summary
该协议描述了一种使用环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器，cAMP原 位 差异检测器（cADDis）和微灌注系统的腺病毒递送，通过原代人假胰岛同步获取和共同注册细胞内信号转导事件以及胰岛素和胰高血糖素分泌的方法。
Abstract
朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的特化内分泌和支持细胞的小型 3D 集合，通过降低血糖的 β 细胞分泌胰岛素和升高血糖的 α 细胞分泌胰高血糖素，在控制葡萄糖稳态方面发挥着核心作用。细胞内信号通路，包括由cAMP介导的信号通路，是调节α和β细胞激素分泌的关键。3D胰岛结构虽然对协调胰岛功能至关重要，但对原代人胰岛细胞细胞内信号通路的机制研究提出了实验挑战。为了克服这些挑战和局限性，该协议描述了一个集成的活细胞成像和微流体平台，该平台使用由非糖尿病供体产生的原代人假胰岛，其形态，组成和功能类似于天然胰岛。这些假胰岛通过原代人胰岛细胞的分散和再聚集过程进行大小控制。在分散状态下，胰岛细胞基因表达可以纵;例如，可以引入生物传感器，例如基因编码的cAMP生物传感器cADDis。一旦形成，表达基因编码生物传感器的假胰岛，结合共聚焦显微镜和微周灌注平台，可以同步评估荧光生物传感器动力学以及 α 和 β 细胞激素分泌谱，以更深入地了解细胞过程和功能。
Introduction
朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的微型器官，其功能对于维持葡萄糖稳态至关重要。胰岛素是在葡萄糖代谢、ATP/ADP 比值增加、ATP 敏感钾通道关闭、质膜去极化和细胞外钙流入后从 β 细胞分泌的1。α 细胞分泌胰高血糖素知之甚少，但据推测，细胞内和旁分泌途径有助于胰高血糖素颗粒胞吐作用 2,3,4。1 型和 2 型糖尿病都与胰岛细胞功能障碍有关 5,6,7。因此，阐明介导胰岛激素分泌的细胞内信号通路对于理解胰岛的生理和病理机制至关重要。
胰岛的球形结构给实验带来了一定的障碍。这些挑战包括胰岛大小变化和胰岛的 3D 性质，这会减少胰岛核心内的病毒转导 8,9。为了克服这些挑战，开发了一种假胰岛系统，其中原代人类胰岛分散到单个细胞中，用编码目标靶标的构建体进行腺病毒转导，并重新聚集以形成大小可控的胰岛样结构，称为假胰岛7。与平行培养的来自同一供体的天然胰岛相比，这些假胰岛在形态、内分泌细胞组成和激素分泌方面相似7。该方法允许在整个假胰岛中表达构建体，这意味着它克服了先前对原代人类胰岛进行统一遗传操作的障碍7,8,9。
在该协议中，假胰岛系统与微流控装置集成，以在原代人胰岛细胞中表达生物传感器，并在动态围灌注期间获得假胰岛激素分泌的时间分辨率10,11,12。将假胰岛置于微芯片中，并通过蠕动泵12暴露于稳定流的不同促分泌剂中。该微芯片具有透明的玻璃底部，并安装在共聚焦显微镜上，以通过生物传感器荧光强度的变化来记录细胞内信号传导动力学。生物传感器成像与微过周灌注流出物的收集同步，用于随后分析胰岛素和胰高血糖素分泌7。与大腹膜融合相比，由于与大腹膜腔相比，微流控装置的体积较小，因此这种微腹膜灌注方法允许使用更少的假胰岛7。
为了利用该系统的实用性，在人假胰岛中表达环磷酸腺苷 （cAMP） 原位差异检测 器 （ cADDis） 生物传感器，以评估 cAMP 动力学和激素分泌。cADDis 生物传感器由环状置换绿色荧光蛋白 （cpGFP） 组成，该荧光蛋白位于由 cAMP 2 （EPAC2） 激活的交换蛋白的铰链区域，连接其调节和催化区域。cAMP 与 EPAC2 调控区的结合会引起铰链区域的构象变化，从而增加 cpGFP13 的荧光。细胞内信使（如 cAMP）在上游激活 G 蛋白偶联受体后引发胰岛素和胰高血糖素分泌14。活细胞成像与微腹膜融合相结合，有助于将细胞内 cAMP 动力学与胰岛激素分泌联系起来。具体来说，在该协议中，产生表达cADDis的假胰岛以监测α和β细胞对各种刺激的cAMP反应：低葡萄糖（2mM葡萄糖;G 2）、高葡萄糖加异丁基甲基黄嘌呤（IBMX;20 mM 葡萄糖 + 100 μM IBMX;G 20 + IBMX）和低葡萄糖加肾上腺素（Epi;2 mM葡萄糖+ 1μM Epi;G 2 + Epi）。该治疗工作流程允许 通过 1） IBMX 介导的磷酸二酯酶抑制（通过防止其降解来增强细胞内 cAMP 水平）和 2） 肾上腺素（一种已知的 cAMP 依赖性刺激剂）来评估细胞内 cAMP 动力学，该刺激剂由 β-肾上腺素能受体激活介导。下面详细介绍了设置用于活细胞成像实验的微周灌注装置的步骤，将假胰岛加载到微芯片中，同步活细胞成像和微周灌注，以及通过基于微孔板的激素测定分析生物传感器痕迹和激素分泌。
Protocol
Representative Results
Discussion
微潜灌系统、表达生物传感器的假胰岛和激光扫描共聚焦显微镜的集成允许同步评估细胞内信号转导事件和动态激素分泌谱。动态微周灌注系统可以向假胰岛提供一系列明确的刺激，并允许收集流出物，其中胰岛素和胰高血糖素浓度可以通过市售的ELISA测量。同时，通过共聚焦显微镜平台对表达生物传感器的假胰岛进行活细胞成像，捕获实时生物传感器荧光活性，从而提供有关细胞内信号转导事?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
器官捐献者及其家人因其宝贵的捐献而受到赞赏，国际器官采购组织、医学促进研究所 （IIAM） 和国家疾病研究交流 （NDRI） 因其在使人类胰腺组织可用于研究方面的合作而受到认可。这项工作得到了人类胰岛研究网络 （RRID：SCR_014393）、人类胰腺分析计划 （RRID：SCR_016202）、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442 和 DK20593（范德比尔特糖尿病研究与培训中心）、Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金、JDRF、美国退伍军人事务部 （BX000666）、 美国国立卫生研究院 （T32GM007347）、F30DK134041、F30DK118830 和美国国家科学基金会研究生研究奖学金 （1937963） 的 NIGMS。
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
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