फ्लोरोसेंट बायोसेंसर डायनामिक्स और हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक मूल्यांकन के लिए मानव स्यूडोआइलेट सिस्टम
Summary
यह प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के तुल्यकालिक अधिग्रहण और सह-पंजीकरण और प्राथमिक मानव स्यूडोआइलेट्स द्वारा इंसुलिन और ग्लूकागन के स्राव के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जिसमें चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) बायोसेंसर, सीटू में एक सीएमपी अंतर डिटेक्टर (सीएडीडीआईएस), और एक माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम के एडेनोवायरल वितरण का उपयोग किया जाता है।
Abstract
लैंगरहैंस के अग्नाशयी आइलेट्स, जो पूरे अग्न्याशय में फैले विशेष अंतःस्रावी और सहायक कोशिकाओं के छोटे 3 डी संग्रह हैं, बीटा कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन के स्राव के माध्यम से ग्लूकोज होमियोस्टैसिस के नियंत्रण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, जो रक्त शर्करा को कम करता है, और अल्फा कोशिकाओं द्वारा ग्लूकागन, जो रक्त शर्करा को बढ़ाता है। इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग, जिनमें सीएमपी द्वारा मध्यस्थता शामिल है, विनियमित अल्फा और बीटा सेल हार्मोन स्राव के लिए महत्वपूर्ण हैं। 3 डी आइलेट संरचना, जबकि समन्वित आइलेट फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है, प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों के यांत्रिक अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक चुनौतियां प्रस्तुत करती है। इन चुनौतियों और सीमाओं को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल मधुमेह के बिना दाताओं से उत्पन्न प्राथमिक मानव स्यूडोआइलेट्स का उपयोग करके एक एकीकृत लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का वर्णन करता है जो उनकी आकृति विज्ञान, संरचना और कार्य में देशी आइलेट्स से मिलते जुलते हैं। ये स्यूडोआइलेट्स प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं के फैलाव और पुनर्एकत्रीकरण प्रक्रिया के माध्यम से आकार-नियंत्रित होते हैं। छितरी हुई अवस्था में, आइलेट सेल जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, बायोसेंसर जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीएएमपी बायोसेंसर, सीएडीडीआईएस, पेश किए जा सकते हैं। एक बार बनने के बाद, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले स्यूडोआइलेट्स, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और एक माइक्रोपेरिफ्यूजन प्लेटफॉर्म के साथ संयोजन में, फ्लोरोसेंट बायोसेंसर डायनामिक्स और अल्फा और बीटा सेल हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक मूल्यांकन की अनुमति देते हैं ताकि सेलुलर प्रक्रियाओं और कार्य में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके।
Introduction
लैंगरहैंस के आइलेट्स अग्न्याशय में बिखरे हुए छोटे अंग हैं जिनका कार्य ग्लूकोज होमियोस्टैसिस के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। ग्लूकोज के चयापचय, एटीपी / एडीपी अनुपात में वृद्धि, एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनलों के बंद होने, प्लाज्मा झिल्ली के विध्रुवण और बाह्य कैल्शियम1 की आमद के बाद बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्रावित होता है। अल्फा कोशिकाओं से ग्लूकागन स्राव को कम समझा जाता है, लेकिन यह माना गया है कि इंट्रासेल्युलर और पैराक्राइन मार्ग ग्लूकागन ग्रेन्युल एक्सोसाइटोसिस 2,3,4 में योगदान करते हैं। टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों आइलेट सेल डिसफंक्शन 5,6,7 से जुड़े हैं। इसलिए, अग्नाशय ी आइलेट्स में शारीरिक और पैथोलॉजिकल तंत्र को समझने के लिए आइलेट हार्मोन स्राव की मध्यस्थता करने वाले इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों को स्पष्ट करना आवश्यक है।
आइलेट्स की गोलाकार वास्तुकला प्रयोग के लिए कुछ बाधाएं प्रस्तुत करती है। इन चुनौतियों में आइलेट आकार भिन्नता और आइलेट्स की 3 डी प्रकृति शामिल है, जो आइलेट कोर 8,9 के भीतर वायरल ट्रांसडक्शन को कम करती है। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक स्यूडोआइलेट प्रणाली विकसित की गई थी, जिसमें प्राथमिक मानव आइलेट्स को एकल कोशिकाओं में फैलाया जाता है, रुचि के एन्कोडिंग लक्ष्यों के साथ एडेनोवायरल रूप से ट्रांसड्यूस किया जाता है, और आकार-नियंत्रित, आइलेट जैसी संरचनाओं को बनाने के लिए पुन: एकत्रित किया जाता है जिसे स्यूडोआइलेट्स7 कहा जाता है। एक ही दाता से देशी आइलेट्स की तुलना में जिन्हें समानांतर में सुसंस्कृत किया गया है, ये स्यूडोआइलेट्स आकृति विज्ञान, अंतःस्रावी कोशिका संरचना और हार्मोन स्राव7 में समान हैं। यह विधि पूरे स्यूडोआइलेट में संरचनाओं की अभिव्यक्ति की अनुमति देती है, जिसका अर्थ है कि यह प्राथमिक मानव आइलेट्स 7,8,9 के समान आनुवंशिक हेरफेर के लिए पिछली बाधा को दूर करता है।
इस प्रोटोकॉल में, स्यूडोआइलेट प्रणाली को प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं में बायोसेंसर को व्यक्त करने और गतिशील पेरिफ्यूजन10,11,12 के दौरान स्यूडोइलेट हार्मोन स्राव के अस्थायी संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ एकीकृत किया जाता है। स्यूडोआइलेट्स को एक माइक्रोचिप में रखा जाता है और एक पेरिस्टालिक पंप12 के माध्यम से विभिन्न स्रावकों के स्थिर प्रवाह के संपर्क में लाया जाता है। माइक्रोचिप में एक पारदर्शी ग्लास बॉटम होता है और बायोसेंसर फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन के माध्यम से इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लगाया जाता है। बायोसेंसर इमेजिंग को इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव के बाद के विश्लेषण के लिए माइक्रोपेरिफ्यूजन बहिस्त्राव के संग्रह के साथ सिंक्रनाइज़ कियाजाता है। मैक्रोपेरिफ्यूजन की तुलना में, यह माइक्रोपेरिफ्यूजन दृष्टिकोण मैक्रोपेरिफ्यूजन चैंबर7 की तुलना में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की छोटी मात्रा के कारण कम स्यूडोआइलेट्स का उपयोग करने की अनुमति देता है।
इस प्रणाली की उपयोगिता का उपयोग करने के लिए, चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) अंतर डिटेक्टर इन सीटू (सीएडीडीआईएस) बायोसेंसर को सीएमपी गतिशीलता और हार्मोन स्राव का आकलन करने के लिए मानव स्यूडोआइलेट्स में व्यक्त किया गया था। कैडिस बायोसेंसर एक गोलाकार हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीपीजीएफपी) से बना है, जो सीएमपी 2 (ईपीएसी 2) द्वारा सक्रिय एक्सचेंज प्रोटीन के हिंज क्षेत्र में स्थित है, जो इसके नियामक और उत्प्रेरक क्षेत्रों को जोड़ता है। ईपीएसी 2 के नियामक क्षेत्र में सीएमपी का बंधन हिंज क्षेत्र में एक संवहन परिवर्तन प्राप्त करता है जो सीपीजीएफपी13 से प्रतिदीप्ति बढ़ाता है। सीएमपी जैसे इंट्रासेल्युलर संदेशवाहक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स14 के अपस्ट्रीम सक्रियण के बाद इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव प्राप्त करते हैं। माइक्रोपेरिफ्यूजन के साथ युग्मित लाइव-सेल इमेजिंग आइलेट हार्मोन स्राव के साथ इंट्रासेल्युलर सीएमपी गतिशीलता को जोड़ने में मदद करता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में, विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए अल्फा और बीटा कोशिकाओं में सीएमपी प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए सीएडीआईएस-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स उत्पन्न होते हैं: कम ग्लूकोज (2 एमएम ग्लूकोज; जी 2), उच्च ग्लूकोज प्लस आइसोब्यूटिलमिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स; 20 एमएम ग्लूकोज + 100 μM IBMX; जी 20 + आईबीएमएक्स), और कम ग्लूकोज प्लस एपिनेफ्रीन (एपि; 2 एमएम ग्लूकोज + 1 μM एपि; जी 2 + एपि)। यह उपचार वर्कफ़्लो सीधे इंट्रासेल्युलर सीएमपी गतिशीलता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है 1) आईबीएमएक्स-मध्यस्थता फॉस्फोडिएस्टरेज़ निषेध, जो इसके क्षरण को रोककर इंट्रासेल्युलर सीएमपी स्तर को बढ़ाता है, और 2) एपिनेफ्रीन, अल्फा सेल ग्लूकागन स्राव का एक ज्ञात सीएमपी-निर्भर उत्तेजक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की जाती है। लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए माइक्रोपेरिफ्यूजन उपकरण स्थापित करने के चरण, माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स की लोडिंग, सिंक्रोनस लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन, और माइक्रोप्लेट-आधारित हार्मोन परख द्वारा बायोसेंसर निशान और हार्मोन स्राव का विश्लेषण नीचे विस्तृत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम, बायोसेंसर-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स और लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का एकीकरण इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं और गतिशील हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक म?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अंग दाताओं और उनके परिवारों को उनके अमूल्य दान के लिए सराहा जाता है, और इंटरनेशनल इंस्टीट्यूट फॉर ऑर्गन प्रोक्योरमेंट ऑर्गनाइजेशन, एडवांसमेंट ऑफ मेडिसिन (आईआईएएम) और नेशनल डिजीज रिसर्च एक्सचेंज (एनडीआरआई) को अनुसंधान के लिए मानव अग्नाशय के ऊतकों को सुलभ बनाने में उनकी साझेदारी के लिए स्वीकार किया जाता है। इस काम को ह्यूमन आइलेट रिसर्च नेटवर्क (आरआरआईडी: SCR_014393), मानव अग्न्याशय विश्लेषण कार्यक्रम (आरआरआईडी: SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 और DK20593 (वेंडरबिल्ट डायबिटीज रिसर्च एंड ट्रेनिंग सेंटर), लियोना एम और हैरी बी हेल्मस्ले चैरिटेबल ट्रस्ट, जेडीआरएफ, यूएस डिपार्टमेंट ऑफ वेटरन्स अफेयर्स (BX000666) द्वारा समर्थित किया गया था। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (1937963) के एनआईजीएमएस।
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
