Summary
Apresentamos aqui um protocolo visual detalhado para a execução do modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) no embrião aviário. O modelo LAL altera o fluxo intracardíaco, o que altera a carga de tensão de cisalhamento da parede, mimetizando a síndrome da hipoplasia do coração esquerdo. Uma abordagem para superar os desafios deste difícil modelo de microcirurgia é apresentada.
Abstract
Devido à sua configuração ventricular madura de quatro câmaras, facilidade de cultivo, acesso à imagem e eficiência, o embrião aviário é um modelo animal vertebrado preferido para estudar o desenvolvimento cardiovascular. Estudos com o objetivo de compreender o desenvolvimento normal e o prognóstico das cardiopatias congênitas adotam amplamente esse modelo. Técnicas cirúrgicas microscópicas são introduzidas para alterar os padrões normais de carregamento mecânico em um ponto de tempo embrionário específico e rastrear a cascata molecular e genética a jusante. As intervenções mecânicas mais comuns são ligadura da veia vitelínea esquerda, bandagem conotruncal e ligadura atrial esquerda (LAE), modulando a pressão vascular intramural e o estresse de cisalhamento da parede devido ao fluxo sanguíneo. O LAL, particularmente se realizado em ovo, é a intervenção mais desafiadora, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas sequenciais extremamente finas. Apesar de seu alto risco, in ovoLAL é muito valioso cientificamente, pois mimetiza a patogênese da síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE). A SHCE é uma cardiopatia congênita complexa e clinicamente relevante observada em recém-nascidos humanos. Um protocolo detalhado para in ovo LAL está documentado neste artigo. Resumidamente, embriões de aves fertilizados foram incubados a 37,5 °C e 60% de umidade constante tipicamente até atingirem os estágios 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). As cascas dos ovos foram abertas e as membranas externa e interna foram removidas. O embrião foi rodado suavemente para expor o bulbo atrial esquerdo do átrio comum. Micronós pré-montados a partir de pontos de náilon 10-0 foram suavemente posicionados e amarrados ao redor do broto atrial esquerdo. Finalmente, o embrião foi devolvido à sua posição original, e LAL foi completado. Ventrículos normais e instrumentados em LAL demonstraram diferenças estatisticamente significativas na compactação tecidual. Um pipeline eficiente de geração de modelos LAL contribuiria para estudos com foco na manipulação mecânica e genética sincronizada durante o desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Da mesma forma, este modelo fornecerá uma fonte de células perturbadas para pesquisa em cultura de tecidos e biologia vascular.
Introduction
As cardiopatias congênitas (DCC) são distúrbios estruturais decorrentes do desenvolvimento embrionário anormal1. Além das condições genéticas, a patogênese é influenciada pela carga mecânica alterada 2,3. A síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE), uma cardiopatia congênita, resulta em ventrículo/aorta subdesenvolvidos ao nascimento4 com alta taxa de mortalidade 5,6. Apesar dos recentes avanços em seu manejo clínico, a dinâmica de crescimento e desenvolvimento vascular da SHCE ainda nãoestá clara7. No desenvolvimento embrionário normal, o endocárdio e o miocárdio do ventrículo esquerdo (VE) originam-se de progenitores cardíacos à medida que a formação precoce do tubo cardíaco embrionário progride. É relatada a presença gradual de trabeculação miocárdica, espessamento das camadas e proliferação de cardiomiócitos2. Para a SHCE, observa-se alteração do remodelamento trabecular e achatamento do ventrículo esquerdo, contribuindo ainda mais para a hipoplasia miocárdica devidoà migração anormal de cardiomiócitos2,8,9,10
Dentre os organismos-modelo amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento cardíaco e compreender as condições hemodinâmicas 11, o embrião aviário é preferido devido ao seu coração maduro de quatro câmaras e à facilidade de cultivo11,12,13,14. Por outro lado, o acesso avançado à imagem de embriões de peixe-zebra e camundongos transgênicos/knockout oferece vantagens distintas11,12. Várias intervenções mecânicas têm sido testadas para o embrião aviário que alteram a pressão intramural e a tensão de cisalhamento da parede no desenvolvimento de componentes cardiovasculares. Esses modelos incluem ligadura vitelíntica esquerda, bandagem conotruncal15 e ligadura atrial esquerda (LAL)11,12,16. O fenótipo resultante devido à carga mecânica alterada pode ser observado aproximadamente 24-48 h após a intervenção cirúrgica em estudos com foco no prognóstico precoce11,13. A intervenção no LAL é uma técnica popular para estreitar o volume funcional do átrio esquerdo (AE) através da colocação de uma alça de sutura ao redor da abertura atrioventricular. Da mesma forma, intervenções microcirúrgicas também têm sido realizadas visando a ligadura atrial direita (RAL)17,18. Da mesma forma, alguns pesquisadores têm como alvo o apêndice atrial esquerdo (AAE) utilizando microclipes para reduzir o volume do AE 19,20. Em alguns estudos, um fio de náilon cirúrgico é aplicado no nó atrioventricular19,21. Uma das intervenções utilizadas é o LAL, que pode mimetizar a SHCE, mas também é o modelo mais difícil de ser realizado, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas extremamente finas necessárias. Em nosso laboratório, o LBA é realizado em ovo entre os estágios 20 e 21 de Hamburger-Hamilton (HH), antes que o átrio comum esteja completamente septado6,14,22,23. Uma sutura cirúrgica é colocada ao redor do AL, o que altera as correntes sanguíneas intracardíacas. Nos modelos de LAL da SHCE, observa-se aumento da rigidez da parede do ventrículo, alteração dos ângulos das miofibras e diminuição do tamanho da cavidade do VE14,24.
Neste artigo em vídeo, um protocolo detalhado e abordagem para in ovo LAL é fornecido. Resumidamente, os embriões de aves fertilizados foram incubados para microcirurgia, a casca do ovo foi rachada e as membranas externa e interna foram limpas. O embrião foi então girado lentamente para que o AE fosse acessível. Uma sutura cirúrgica com náilon 10-0 foi amarrada ao broto atrial e o embrião foi devolvido à sua orientação original, completando o procedimento LAL25. LAL e ventrículos normais são comparados quanto à compactação do tecido e volume ventricular através de tomografia de coerência óptica e histologia básica.
Um pipeline de modelos LAL executado com sucesso, como descrito aqui, contribuirá para estudos básicos com foco no desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Este modelo também pode ser usado em conjunto com manipulações genéticas e modalidades avançadas de imagem. Da mesma forma, o modelo LAL agudo é uma fonte estável de células vasculares doentes para experimentos de cultura de tecidos.
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Protocol
Os ovos brancos férteis de Leghorn são obtidos de fornecedores confiáveis e incubados de acordo com as diretrizes aprovadas pela universidade. Embriões de pintinhos, estágios 18 (dia 3) a 24 (dia 4) (os estágios apresentados neste artigo) não são considerados animais vertebrados vivos pela diretiva 2010/63/EU da União Europeia (UE) e pelas diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) nos EUA. Os embriões de pintinhos são considerados "animais vivos" após o 19º dia de incubação de acordo com as leis dos EUA, mas não para a UE. Cada ovo é rotulado com a data de início da eclosão e está programado para eclodir o mais tardar no10º dia de incubação. Após a eclosão dos ovos, os filhotes são retirados da incubadora. O protocolo é realizado em duas estações de operação de bancada (Estação 1 e Estação 2), com foco em etapas especializadas de geração de modelos.
1. Preparo antes da microcirurgia
- Obtenha ovos fertilizados de um centro de desenvolvimento de vacinas com um grau específico livre de patógenos (SPF) ou através de uma fazenda de fornecedor comercial confiável por um mensageiro de entrega frágil em recipientes secos de poliestireno. Antes da incubação, limpe suavemente a casca do ovo com lenços sem fiapos embebidos em etanol 70% para remover a contaminação.
- Critérios de inclusão/exclusão de embriões
- Não incube ovos que foram rachados ou danificados durante o transporte.
- Se for observado sangramento durante o procedimento LAL ou após a reincubação, não use o embrião.
- Não use embriões que se desenvolvam na posição do lado esquerdo para cima, pois o fluxo sanguíneo hemodinâmico pode diferir da orientação normal.
- Embriões de Dıscard desenvolvendo-se com defeitos congênitos em procedimentos pré e pós-cirúrgicos.
- Incluir embriões que atinjam o estágio alvo de desenvolvimento em sua localização original, imitando a SHCE como um modelo LAL.
- Incubar os ovos de galinha (Gallus gallus domesticus L .), fertilizados, até o estágio desejado tipicamente em HH20-2115 (37,5 °C, 60% de umidade, 3,5 dias) (Figura 1).
OBS: É importante manter os ovos em temperatura e umidade constantes para aumentar o rendimento. Dependendo do modelo da incubadora, a adição de uma panela cheia de água destilada manterá a umidade estável. Plantas de um sistema de controle de temperatura e umidade adicional/auxiliar que se encaixaria na maioria das incubadoras são desenvolvidas pelos autores e recomendadas. Os detalhes eletrônicos, de hardware e de código dessa unidade de sensor/controle construída internamente são fornecidos em um repositório de dados26. A agitação suave contínua (rotação) dos ovos durante a incubação pode permitir o posicionamento ideal do embrião e, assim, levar a uma maior porcentagem de embriões "operáveis". A agitação também pode trabalhar com incubadoras com essa capacidade e aumentar ainda mais a produtividade. - Antes de iniciar o procedimento, prepare o número necessário de nós amarrando um nó overhand solto em uma sutura 10-0 de 1,5 cm de comprimento. Certifique-se de que o nó não é apertado e é grande o suficiente para caber sobre os átrios facilmente durante a operação (Figura 2).
NOTA: Amarre os nós antes do tempo e mantenha-os em uma solução estéril de campainha de pintinho antes de usar. A operação de amarração de nós requer o uso de duas mãos para operar a pinça de forma síncrona. Por se tratar de uma etapa crítica do protocolo, pode-se confeccionar um modelo de átrio para a prática dessa etapa (Figura 3). Isso melhorará as habilidades de microcirurgia tridimensional necessárias para executar o passo 3.2.3 na Estação 2 (Figura 4).
2. Operações na Estação 1 (Figura 4A)
- Abra uma janela da extremidade romba do ovo e remova as membranas externa e interna15 (Figura 5A-D).
- Abra a casca do ovo rachando suavemente com a extremidade inversa da pinça, com os dedos livres apoiando firmemente o ovo para reduzir a propagação indesejada de rachaduras.
- Como o LAL é um procedimento longo, conserve a temperatura e a umidade do embrião, pois a frequência cardíaca depende da temperatura. Assim, certifique-se de que a janela inicial do shell seja criada o menor possível, apenas o suficiente para executar as operações.
NOTA: Nenhum sistema de controle de umidade ou temperatura é empregado durante a operação, mas esses sistemas, se disponíveis, beneficiariam o rendimento. Se possível, o sistema de ar condicionado no laboratório é desligado e o procedimento é realizado na temperatura ambiente (RT) mais alta possível. A otimização da frequência cardíaca embrionária, que pode ser controlada pela temperatura, durante a operação também é recomendada. Alguns laboratórios mantêm a frequência cardíaca em taxas ligeiramente inferiores a 120 bpm através do controle de temperatura durante a operação LAL. Dessa forma, o controle da umidade empregado ao redor da zona cirúrgica aumentaria ainda mais o rendimento. As janelas da casca do ovo são criadas o menor possível, apenas grandes o suficiente para permitir o acesso cirúrgico. Isso também é aplicável à membrana externa espessa, que normalmente é menor do que a casca do ovo apenas na extensão da circunferência do embrião. Estes garantem a manutenção da temperatura e umidade do embrião. Ao abrir uma janela da extremidade romba do ovo, os pequenos fragmentos de casca são limpos para que esses pedaços não danifiquem a integridade vascular da vitelina ou levem a artefatos indesejados. Além disso, outros laboratórios usam tesouras curvas microsserrilhadas para fazer janelas. Além disso, duas larguras de fita Scotch podem ser usadas para estabilizar a casca do ovo para controlar a rachadura. - Remova apenas a membrana de vitelina necessária usando micro tesoura (Vídeo Suplementar 1).
- O desenvolvimento embrionário normal é do lado direito para cima. Uma vez que o embrião esteja livre da membrana vitelina, coloque a pinça com as pontas fechadas sob o segmento dorsal do embrião e vire suavemente o embrião para expor o lado esquerdo (ou seja, configuração do lado esquerdo para cima) (Figura 6A,B; Vídeo Suplementar 2).
- Certifique-se de que o broto atrial esquerdo esteja agora exposto, mas ainda coberto por um complexo sistema de membrana, tipicamente consistindo de uma dupla camada do pericárdio.
- Remova as membranas, incluindo as finas, imediatamente ao redor do broto atrial. Esta é outra etapa crítica; realizar a remoção da membrana das membranas grosseiras e progredir para as finas ao redor do broto atrial esquerdo. Reserve as pinças mais finas para remoção da membrana fina (Vídeo Suplementar 3).
- Durante o processo de remoção da membrana, orientar o embrião em uma posição do lado esquerdo para cima, de modo que a operação de colocação do nó na etapa 3.2 possa ser realizada sem reposicionamento adicional. Para conseguir isso, levante o embrião usando as membranas na etapa 2.6 e pendure-o na casca do ovo, garantindo que o lado esquerdo fique voltado para cima.
NOTA: Alguns embriões podem estar localizados próximos à periferia da casca do ovo e podem ser difíceis de operar. Ainda assim, esses embriões provavelmente serão orientados para o lado direito e apresentarão comportamento normal, e podem ser incluídos no estudo. Nesses casos, se necessário, o átrio obscurecido pode ser tornado mais acessível limpando-se suavemente a membrana pericárdica com pinça fina #4 e removendo a casca do ovo no sentido inverso (em direção à abertura da casca). Esses embriões também podem ser levantados usando partes das membranas extraembrionárias e fixados na posição desejada, prendendo uma extremidade da membrana (a extremidade da pinça) à casca do ovo, usando sua aderência natural. Além disso, o espaço entre a cabeça e a região da medula espinhal do embrião pode ser expandido com a ajuda de uma pinça para revelar o átrio obscurecido.
3. Operações na Estação 2 (Figura 4B)
- Sob o estereomicroscópio, posicionar o nó pré-preparado do passo 1.4 próximo ao embrião em local acessível (Figura 6B). O broto atrial já está pronto para ser amarrado (Vídeo Suplementar 4).
- Recuperar o nó aberto pré-preparado e orientá-lo sobre o botão atrial esquerdo. Para que o LAL funcione, coloque o ovo em uma orientação tridimensional exclusivamente inclinada.
- Orientar corretamente o nó para executar o processo de aperto sem danificar os embriões.
- Limpe as membranas finas de forma ideal no passo 2.7 para reduzir o efeito de um coração batendo.
- Apertar a sutura (Figura 6C). Para essa etapa, praticar com a massa é muito útil. Para embriões falsos, aperte o nó apenas o suficiente para segurar o nó.
- Em seguida, utilizar a microtesoura para cortar o excesso de extremidades da sutura o mais próximo possível da gema (Vídeo Suplementar 5).
- Tenha muito cuidado para que as extremidades recém-cortadas da sutura amarrada não estejam em posição de perfurar vasos próximos durante a rotação ou devido aos batimentos cardíacos.
- Com a pinça, retirar o excesso de sutura cortado no passo 3.3.
- Por fim, utilizando pinça fechada, devolva o embrião à sua posição original, como na etapa 2.5 (Vídeo Suplementar 6).
- Depois de completar o processo LAL, cubra o ovo com uma camada dupla de parafilme e incube-o novamente. Um fechamento apertado e estéril dos ovos é fundamental para a sobrevivência, especialmente após 24 h de incubação. Se o acesso visual também for desejado, use cera de parafina com lâminas de vidro.
NOTA: À medida que o período embrionário inicial é estudado, os ovos são tipicamente incubados por 24-48 h até atingirem aproximadamente HH25 ou HH27. No entanto, não há limite, e etapas posteriores podem ser estudadas, como tentado por outros pesquisadores. Para velocidades de operação rápidas, recomenda-se pelo menos uma equipe de duas pessoas. Uma pessoa deve ser treinada e é responsável pela abertura do ovo, limpeza inicial da membrana, rotação e limpeza da membrana ao redor do broto atrial esquerdo. A outra pessoa é responsável apenas pela preparação inicial do nó, colocação do nó e aperto. A rotação final do embrião pode ser realizada pela Pessoa 1. A operação cirúrgica para um único embrião leva cerca de 4-5 minutos. - Antes/depois das operações cirúrgicas, limpe as superfícies de bancada e os instrumentos com etanol. Certificar-se de aplicar solução fresca de ringer de pintinho (NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3)16,27 nos instrumentos metálicos que tocam os tecidos embrionários.
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Representative Results
Técnicas avançadas de imagem resolvidas no tempo podem ser empregadas para observar as alterações estruturais e morfológicas decorrentes da intervenção LAL10. Além disso, amostras de LAL também são passíveis de métodos moleculares e biológicos19,28. Na Tabela 1, são apresentados os estudos amostrais que utilizaram os resultados do modelo LAL. Nesse contexto, a intervenção LAL foi realizada em embriões de pintinhos que atingiram HH20-21. Tanto o coração controle (saudável) quanto o LAL foram retirados do embrião em HH25-26. Em seguida, as amostras foram fixadas em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C 6,15. As amostras cardíacas retiradas foram então desidratadas em soluções de etanol de concentrações crescentes (70%, 96% e 100%) por 1 h cada. Finalmente, as amostras foram mantidas em xilol em TR por 0,5 h, e a inclusão em parafina foi realizada antes da secção, com espessura de 10 μm. As amostras transferidas para a lâmina de vidro foram coradas com Elastica van Gieson. Os cortes foram examinados em estereomicroscópio, onde foi medido o diâmetro transversal do ventrículo. Também realizamos um método tridimensional não invasivo, a tomografia de coerência óptica (OCT), em algumas amostras11,29. Tanto o coração controle quanto o LAL na HH25-26 foram excisados, e seus diâmetros de luz cruzada foram medidos sob OCT.
Os resultados mostraram que, para o LAL, obtém-se uma estrutura miocárdica mais compacta, com alterações morfológicas significativas em relação ao desenvolvimento normal (Figura 7). Além disso, observa-se deposição de componentes da matriz extracelular, como colágeno, ao redor do interstício cardíaco, assemelhando-se à fibrose miocárdica semelhante à SHCE30. Para melhor compreensão do espessamento miocárdico e da compactação trabecular, foram realizadas medidas morfométricas de porosidade em amostras controle e LAL. Como esperado, a intervenção no LAL resultou em menor cavidade ventricular esquerda e compactação trabecular pelo aperto dos recessos intertrabeculares. Esses achados confirmam a hipótese de que o LAL altera a arquitetura ventricular normal e reorienta o aspecto trabecular22. Da mesma forma, o modelo LAL na HH29 resultou em aumento da cavidade ventricular direita, alteração da arquitetura trabecular e do volumemiocárdico24.
Para corroborar os resultados obtidos neste estudo, a OCT foi utilizada para medir a área transversa e o comprimento axial da luz ventricular (Figura 8). O LAL mostrou redução significativa do tamanho e diâmetro do ventrículo esquerdo em relação ao controle. Embora apenas os ventrículos estejam aqui enfocados, a influência do LAL no desenvolvimento do arco aórtico também érelatada31. Um estudo recente que contribuímos para relatar, em 3D, que as tensões miocárdicas de parede média estavam aumentadas em ambos os ventrículos após LAL na HH2532. Além disso, os grupos LAL exibiram um aumento na espessura da parede em comparação com os grupos controle na HH25. Este estudo é consistente com o estudo anterior de Tobita et al.25, que demonstrou aumento significativo dos picos de seduções circunferenciais epicárdicas sistólicas no LE na HH27.
Figura 1: Sistema de incubação para crescimento embrionário. Ovos de galinha Leghorn (Gallus gallus) brancos fertilizados foram incubados em estufa com umidade (60%) e temperatura (37,5 °C) constantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparo do nó LAL. Múltiplos nós ~0,5-1 mm de diâmetro e peças de 1-2 cm de comprimento foram preparados com suturas cirúrgicas de náilon 10-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Réplica do átrio esquerdo embrionário confeccionada em massa de massa. Uma réplica da seção atrial esquerda é criada para treinar e praticar a orientação do nó e os passos de fechamento do nó usando duas pinças. Isso nos permitiu fazer muitos testes e aperfeiçoar essas etapas antes de implementar essa habilidade no embrião real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Preparação da estação . (A,B) Todos os materiais e soluções para microcirurgia foram colocados na área limpa para a Estação 1 e Estação 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Abertura de uma janela da extremidade romba do ovo e remoção das membranas externa e interna. (A,B) Uma pequena janela foi aberta com instrumental microcirúrgico na casca do ovo e incluindo todo o embrião em HH20-21. (C) Fragmentos da casca do ovo foram removidos na primeira etapa de fissuração. (D,E) Membranas extraembrionárias também foram dissecadas ao microscópio. (F) Após o término do processo LAL, o ovo foi coberto com uma dupla camada de parafilme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Instantâneo da cirurgia in ovo de ligadura atrial esquerda (LAL). (A) Vista dorsal do embrião do pintinho em sua orientação normal. O ventrículo embrionário que atinge a HH20-21 possui átrio comum primitivo (a), ventrículo (v) e via de saída (ot). (B) Uma visão dorsal em close-up do embrião invertido, do lado esquerdo para cima e a localização do nó é exibida. (C) AE com o nó de sutura. Abreviações: AE = átrio esquerdo; AA = arco aórtico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Remoção e exame dos corações controle e LAL. Tanto os corações (A) controle quanto (B) LAL que atingiram o estágio HH25-26 foram retirados do embrião e examinados sob estereomicroscópio. O gráfico de barras mostra as diferenças no diâmetro do coração transversal entre o grupo LAL e o grupo controle, e a média ± desvio padrão (DP) de pelo menos quatro repetições. Barra de escala = 100 μM. Exame histológico dos tecidos cardíacos em amostras de (C) controle e (D) LAL utilizando a técnica de coloração Elastica van Gieson. O gráfico de barras mostra as diferenças de porosidade (%) para mostrar compressão miocárdica entre o grupo LAL e o grupo controle, e a média ± DP de pelo menos duas repetições. **p < 0,01. Para a análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 9.5.1. Barra de escala = 50 μM. Abreviações: LAL = ligadura atrial esquerda; AE = átrio esquerdo; AR = átrio direito; VD = ventrículo direito; VE = ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Tomografia de coerência óptica. Tanto o (A) controle quanto o (B) LAL atingindo HH25-26 foram examinados por OCT. (C,D) O tamanho e o comprimento do lúmen cruzado dos ventrículos estão indicados nos painéis (C) e (D), respectivamente. Os histogramas representam a média ± DP com pelo menos três repetições. *p < 0,05; **p < 0,01; Para a análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 9.5.1. Barra da escala = 100 μM. Abreviações: LAL = ligadura do átrio esquerdo; VD = ventrículo direito; VE = ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Revisão de pesquisas que empregam o modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) em embriões aviários 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
Em quase todos os artigos, o LA está empatado em HH21. O efeito do LAL é investigado em estágios posteriores da HM (fase de avaliação). Abreviações: AVC = coxim atrioventricular; VAE= canal atrioventricular esquerdo; RAV = canal atrioventricular direito; AR = átrio direito; AE = átrio esquerdo; VD = ventrículo direito; VE = ventrículo esquerdo; NEE = subendocárdio; SIV = septo interventricular; micro-TC = microtomografia computadorizada. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Efetividade típica do modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) criado na HH21 e incubado até a HH25. Clique aqui para baixar esta tabela.
Vídeo Suplementar 1: As membranas externa e interna do embrião aviário são removidas. Em seguida, apenas a membrana vitelínica é removida, como mostrado usando micro tesoura. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 2: Pinças são colocadas sob o segmento dorsal do embrião do lado direito e cuidadosamente viradas para expor seu broto atrial esquerdo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 3: As membranas ao redor do broto atrial esquerdo são gradualmente eliminadas. O átrio expande-se ligeiramente, o que torna possível a colocação de nós e amarração. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 4: Uma sutura de aproximadamente 0,1-0,3 mm de comprimento é posicionada perto do embrião e apertada ao redor dele usando duas pinças. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Complementar 5: O excesso de sutura das extremidades do nó é cuidadosamente cortado com micro tesoura. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Complementar 6: O embrião é suavemente devolvido à sua orientação normal. LAL está concluída. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Na SHCE, o fluxo sanguíneo é alterado devido a defeitos estruturais, levando a morfologia anormal no lado esquerdo 4,6. O presente modelo fornece um sistema experimental prático para melhor compreender a progressão da SHCE e pode até mimetizar sua patogênese8. No entanto, estabelecer um modelo animal de SHCE clinicamente equivalente é uma tarefa desafiadora. Além do modelo LAL aviário aqui apresentado, estudos recentes em camundongos, ovinos e rãs têm tentado replicar as características morfológicas, hemodinâmicas e fisiopatológicas do prognóstico da SHCE. Em embriões de camundongos, a carga mecânica é alterada através de um agente embolizante injetado no AL através de uma intervenção fetal no dia embrionário (DE) 14,5 (aproximadamente HH40-41 em embriões de pintinhos)34. Um total de 48% dos fetos que foram positivamente embolizados sobreviveram até a gestação com pequenos VE e fluxo retrógrado da aorta. O longo período de gestação, novos desafios nas intervenções em momentos precoces e o desafio da cirurgia fetal podem limitar a viabilidade desse modelo. A hipoplasia do VE também foi mimetizada nos modelos fetais de cordeiros pelo preenchimento do AE com borracha de silicone através de cateter-balão35. Neste modelo animal de grande porte, o volume do VE é suficientemente reduzido, mas o tempo de sobrevida não é longo, resultando em baixa penetração da doença. Uma abordagem de intervenção alternativa é a oclusão do forame oval por cateterismo trans-hepático percutâneo, como tentado em cordeiros fetais36, embora o direcionamento do stent oclusivo para o forame oval seja um grande desafio. Os modelos ovinos em geral são muito desafiadores devido às suas morfologias vasculares pré-existentes e fisiologia pulmonar adversa. Dessa forma, a necessidade de reprodução sazonal, idade gestacional mais tardia e pequeno tamanho da amostra limitam ainda mais esse modelo. Finalmente, o embrião de Xenopus também é introduzido como outro modelo conveniente para mimetizar cardiopatia humana37, apesar de seu coração de três câmaras com um único ventrículo e diferenças nos padrões celulares da crista neural. A disponibilidade de microinjeção e intervenções microcirúrgicas estabelecidas no genoma completo e o longo tempo de sobrevida também tornam esse modelo atraente.
Em estudos anteriores, a penetração da doença em seis dos 39 embriões aviários operados foi apresentada como 15% no modelo LAL34. No entanto, a penetração média de SHCE do modelo embrionário de pintinho que examinamos no estágio inicial (atingindo HH25 e HH27) foi de 66% (12 de 18 embriões aviários operados). O Prof. Sedmera relatou que o tempo médio de sobrevivência dos embriões poderia ser HH40 (DE14)19. Outros grupos que realizam regularmente essa ligadura relataram altas taxas de sucesso nos momentos iniciais (por exemplo, 75% até HH29, 50% até HH34 e 20% até HH38)30. No entanto, em estágios mais avançados, um fenótipo distinto emerge e a mortalidade aumenta. Embora a penetração da doença possa ser relativamente baixa em embriões de pintinhos, o objetivo desse modelo é examinar melhor a etiologia e a patologia da SHCE pré-natal, especialmente nos estágios iniciais.
Devido ao tamanho muito pequeno do embrião de pintinho em estágio inicial, a intervenção pré e pós-operatória do LAL pode levar a várias complicações. Como remédio para evitar contaminação, cascas de ovos e bancos são limpos com etanol 70%, e luvas podem ser usadas durante todo o procedimento. Uma etapa crítica no protocolo LAL é a remoção de toda a membrana pericárdica para permitir um bom encaixe do nó ao redor do broto atrial esquerdo. Além disso, achamos a equipe de duas pessoas extremamente útil, particularmente no treinamento e especialização em um conjunto de habilidades específicas necessárias durante as etapas do protocolo. Essa abordagem acelera o procedimento e sua curva de aprendizado. Como tal, o risco de sangramento e contaminação é secundário e supera os benefícios do sistema de amigos proposto. Recomenda-se o uso de uma sutura pré-preparada armazenada em uma solução estéril de campainha de pintinho. Além disso, manter uma baixa força de aperto da sutura também é fundamental para um maior rendimento embrionário. Nós mais apertados no broto atrial aplicados na HH21 podem levar à falência prematura do VE, incapaz de elaborar o compromisso clinicamente crítico dos defeitos de remodelamento da mioarquitetura, coronária e secundária, que foram bem descritos em estudosprévios22. Especificamente, usar as pinças e tesouras mais finas e não utilizadas em certas etapas e relativamente contundentes em outras pode reduzir o sangramento acidental. Finalmente, imediatamente após a conclusão do nó, o embrião deve ser girado para sua posição original rapidamente, e a janela da casca do ovo deve ser fechada com uma camada dupla de parafilme para preservar sua temperatura e umidade. O rendimento típico para o modelo LAL atingir HH25 é apresentado na Tabela 2. Além da diminuição do tamanho ventricular, malformações valvares também podem se desenvolver, como atresia mitral/aórtica. A gravidade dessas lesões aumenta a morbidade em estágios mais avançados, como na SHCE. Devido aos desafios aqui discutidos, em comparação com outras intervenções mecânicas realizadas em embriões de pintinhos, como a bandagem conotruncal, o modelo LAL resulta em níveis de rendimento muito mais baixos. Acreditamos que, através das precauções aqui apresentadas, um rendimento de 50% é alcançável.
O embrião aviário é um modelo animal de vertebrado ideal para pesquisa do desenvolvimento cardiovascular devido à sua estrutura morfológica, tamanho, baixo custo, facilidade de cultivo e manipulação38,39. Esse modelo também fornece proteção natural contra patógenos40. Embriões instrumentados podem ser utilizados em imagens in vivo avançadas e manipulação local de siRNA. Como tal, regiões gênicas conservadas do ser humano e da galinha estão disponíveis por meio do sequenciamento da espingarda de Sanger e do mapeamento físico39, levando a estudos mecanossensíveis avançados19. Além disso, a abordagem de microarranjos aplicada por Krejčí e col. tem sido utilizada para medir o sucesso quanto à potencial reversibilidade das alterações hemodinâmicas na estrutura miocárdica. Assim, a identificação de genes diferencialmente expressos entre os ventrículos esquerdo e direito pode ser utilizada como critério para o período ideal de intervenção quando se iniciam alterações irreversíveis33.
Em conclusão, potenciais direções futuras para aplicações microcirúrgicas no modelo de embrião de pintinho incluem o uso de técnicas de edição de genes cardiovasculares com foco em genes de matriz específicos e vias de sinalização molecular, apoiando avanços em cultura tecido-celular e tecnologias de imagem32.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos o prêmio Tubitak 2247A de pesquisador líder 120C139 fornecendo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer a PakTavuk Gıda. A. S., Istambul, Turquia, pelo fornecimento de ovos férteis e apoio à pesquisa cardiovascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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