Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

توصيف مورفولوجيا الأوعية الدموية للتنكس البقعي المرتبط بالعمر الوعائي الحديث بواسطة تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين

Published: August 11, 2023 doi: 10.3791/65682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Cullen Eye Institute, Baylor College of Medicine

Summary

حاليا ، تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) هو الطريقة المفضلة لتحديد أنماط التسرب في النماذج الحيوانية للأوعية الدموية المشيمية (CNV). ومع ذلك ، لا يوفر FA معلومات حول مورفولوجيا الأوعية الدموية. يحدد هذا البروتوكول استخدام تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين (ICGA) لتوصيف أنواع الآفات المختلفة من CNV الناجم عن الليزر في نماذج الفئران.

Abstract

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب الرئيسي للعمى بين الأفراد الأكبر سنا ، ويتزايد انتشاره بسرعة بسبب شيخوخة السكان. الأوعية الدموية المشيمية (CNV) أو AMD الرطب ، والتي تمثل 10٪ -20٪ من جميع حالات AMD ، مسؤولة عن 80٪ -90٪ من العمى المرتبط ب AMD. تظهر العلاجات الحالية المضادة ل VEGF استجابات دون المستوى الأمثل في حوالي 50٪ من المرضى. غالبا ما ترتبط مقاومة العلاج المضاد ل VEGF في مرضى CNV ب CNV الشرياني ، بينما يميل المستجيبون إلى الإصابة ب CNV الشعري. بينما يستخدم تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) بشكل شائع لتقييم أنماط التسرب في مرضى AMD الرطب والنماذج الحيوانية ، فإنه لا يوفر معلومات حول مورفولوجيا الأوعية الدموية CNV (CNV الشرياني مقابل CNV الشعري). يقدم هذا البروتوكول استخدام تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين (ICGA) لتوصيف أنواع الآفات في نماذج فأر CNV التي يسببها الليزر. هذه الطريقة ضرورية للتحقيق في آليات واستراتيجيات العلاج لمقاومة VEGF في AMD الرطب. يوصى بدمج ICGA جنبا إلى جنب مع FA لإجراء تقييم شامل لكل من التسرب والسمات الوعائية ل CNV في الدراسات الميكانيكية والعلاجية.

Introduction

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو حالة سائدة تؤدي إلى فقدان البصر الشديد لدى الأفراد الأكبر سنا1. في الولايات المتحدة وحدها ، من المتوقع أن يتضاعف عدد مرضى AMD ، ليصل إلى ما يقرب من 22 مليون بحلول عام 2050 ، مقارنة ب 11 مليون حاليا. على الصعيد العالمي ، من المتوقع أن يصل العدد التقديري لحالات AMD إلى 288 مليون حالة بحلول عام 20402.

يمكن أن يكون للأوعية الدموية المشيمية (CNV) ، والمعروفة أيضا باسم AMD "الرطب" أو الأوعية الدموية الحديثة ، آثار مدمرة على الرؤية بسبب تكوين أوعية دموية غير طبيعية تحت الشبكية المركزية. هذا يؤدي إلى نزيف ، نضح الشبكية ، وفقدان البصر بشكل كبير. أحدث إدخال علاجات عامل النمو البطاني المضاد للأوعية الدموية (VEGF) ، والتي تستهدف VEGF خارج الخلية ، ثورة في علاج CNV. ومع ذلك ، على الرغم من هذه التطورات ، فإن ما يصل إلى 50 ٪ من المرضى يظهرون استجابات دون المستوى الأمثل لهذه العلاجات ، مع نشاط المرض المستمر مثل تراكم السوائل والنزيف غير المحلوف أو الجديد3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14.

أشارت الدراسات السريرية إلى أن المقاومة المضادة ل VEGF في مرضى CNV غالبا ما تتوافق مع وجود CNV الشرياني ، الذي يتميز بالشرايين المتفرعة ذات العيار الكبير ، والحلقات الوعائية ، والوصلات المفاغرة9. يمكن أن يساهم العلاج المتكرر المضاد ل VEGF في شذوذ الأوعية الدموية ، وتطوير CNV الشرياني ، وفي النهاية مقاومة العلاجات المضادة ل VEGF14,15. في حالات CNV الشرياني ، من المحتمل أن يكون تسرب السوائل المستمر بسبب زيادة النضح الناجم عن الوصلات الضيقة غير المتكونة بشكل كاف في حلقات المفاغرة الشريانية الوريدية ، خاصة في ظل ظروف ارتفاع تدفق الدم9. على العكس من ذلك ، يميل الأفراد الذين يستجيبون بشكل جيد للعلاج المضاد ل VEGF إلى إظهار CNV الشعري.

في دراساتنا باستخدام النماذج الحيوانية ، أثبتنا أن CNV الناجم عن الليزر في الفئران الأكبر سنا يطور CNV الشرياني ويظهر مقاومة للعلاج المضاد ل VEGF16,17. على العكس من ذلك ، يؤدي CNV الناجم عن الليزر في الفئران الأصغر سنا إلى تطوير CNV الشعري والاستجابة العالية للعلاج المضاد ل VEGF. وبالتالي ، من الأهمية بمكان التمييز بين أنواع الأوعية الدموية CNV لكل من التحقيقات الميكانيكية والعلاجية.

في الإعدادات السريرية ، يتم تصنيف CNV عادة بناء على أنماط تسرب تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) (على سبيل المثال ، النوع 1 ، النوع 2) ، والتي تستخدم صبغة الفلوريسئين لتتبع النضح وتحديد مناطق التسرب المرضي. في أبحاث AMD ، تتم دراسة CNV في الغالب باستخدام FA في النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، فشل FA في الكشف عن مورفولوجيا الأوعية الدموية ل CNV. علاوة على ذلك ، يلتقط FA الصور فقط في طيف الضوء المرئي ولا يمكنه تصور الأوعية الدموية المشيمية تحت ظهارة صبغة الشبكية (RPE). في المقابل ، فإن الإندوسيانين الأخضر (ICG) ، الذي يظهر تقاربا قويا لبروتينات البلازما ، يسهل الاحتفاظ السائد داخل الأوعية ويتيح تصور بنية الأوعية الدموية وتدفق الدم9. من خلال استخدام خاصية مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة من ICG ، يصبح من الممكن تصوير صبغة الشبكية والمشيمية باستخدام تصوير الأوعية ICG (ICGA). في هذا السياق ، يتم تقديم بروتوكول يجمع بين FA و ICGA للتحقيق في التسرب والتشكل الوعائي للأوعية الدموية المشيمية المستحثة بالليزر (CNV) في الفئران الصغيرة والكبيرة ، حيث يتم ملاحظة CNV الشعري والشرياني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

حصلت التجارب على التي أجريت في هذه الدراسة على موافقة من اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في كلية بايلور للطب. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم استخدام الفئران الصغيرة (7-9 أسابيع) والقديمة (12-16 شهرا) C57BL / 6J من الذكور والإناث في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إعداد نظام التصوير

  1. ضع وسادة تدفئة على منصة التصوير (انظر جدول المواد) لضمان الحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التصوير. قم بتنشيط وسادة التدفئة واضبط درجة الحرارة على 35 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة غطاء الغبار وتشغيل منظار العين الماسح بالليزر. ضع عدسة بزاوية 55 درجة على الجهاز.
  3. قم بإعداد برنامج التصوير (انظر جدول المواد) وإدخال المعلومات الأساسية ، بما في ذلك النمط الجيني والجنس والعمر وما إلى ذلك. عند بدء جلسة التصوير ، حدد IR (قناة الأشعة تحت الحمراء) لالتقاط صور ICGA.

2. إعداد قبل ICGA و FA

  1. قم بوزن الماوس لتحديد كمية التخدير (الكيتامين / زيلازين 70-100 / 2.5-10 مجم / كجم ، انظر جدول المواد) المطلوبة.
    ملاحظة: يعد تحسين الجرعة أمرا بالغ الأهمية لأن ملف التمثيل الغذائي يختلف بين سلالات الفئران المختلفة. من الضروري تحديد الجرعة المناسبة لتجنب استيقاظ الفأر قبل الانتهاء من التصوير أو خطر الجرعة الزائدة والوفيات المحتملة للحيوانات.
  2. استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل مع إبرة 30-32 جم لتوصيل التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق. قرصة بلطف واحدة من الكفوف الماوس للتحقق مما إذا كان الماوس قد تم تخديره بشكل كاف. إذا أظهر أي استجابة أو حركة ، فمن المستحسن الانتظار لفترة إضافية قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. هذا يسمح للحيوان بالاستقرار ويضمن الظروف المثلى للإجراءات اللاحقة.
  3. تطبيق 1٪ محلول تروبيكاميد للعيون قطرات لتوسيع كلتا عيني الفأر. انتظر 30 ثانية على الأقل قبل استخدام قطرات بروباراكايين هيدروكلوريد 0.5٪ (انظر جدول المواد) على كلتا العينين لتقليل حركة العين ورمشها. اتبع ذلك مع قطرات هلام العين زيوت التشحيم.
    ملاحظة: طوال مدة التخدير ، من المهم معالجة مشكلة الجفاف الشديد في عيون الفأر ، والتي يمكن أن تؤدي إلى عتامة القرنية. هذا التعتيم يجعل التصوير اللاحق صعبا بسبب إعاقة الرؤية. لمنع ذلك ، من الضروري تطبيق قطرات جل العين المزلقة باستمرار للحفاظ على ترطيب عيون الماوس.
  4. ضع الماوس على وسادة مياه التدفئة.
    ملاحظة: تمتلك الفئران مساحة سطح عالية إلى نسبة الحجم ، مما يؤدي إلى زيادة فقدان الحرارة في البيئة. عندما يقترن بانخفاض درجة الحرارة الناجم عن التخدير ، يمكن أن يشكل هذا خطرا كبيرا على الماوس ، مما قد يؤدي إلى الوفاة بسبب انخفاض حرارة الجسم. من الأهمية بمكان اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع انخفاض حرارة الجسم وضمان رفاهية الماوس أثناء العملية.
  5. تحضير خليط بحجم 1: 1 من 2 ملغ / مل ICG و 20 ملغ / مل صبغة فلوريسئين (انظر جدول المواد). يتم تطبيق 250 ميكرولتر من الخليط عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة سعة 1 مل وإبرة 32 جم.
    1. أدخل الإبرة في الربع السفلي الأيسر من بطن الفأر بالقرب من الساقين الخلفيتين بزاوية موازية لجلد الفأر لتجنب ثقب أي أعضاء.
    2. اسحب المكبس بعناية وتحقق من عدم دخول أي دم إلى غطاء المحقنة. استمر في حقن الصبغة ببطء وثبات ، مع الحفاظ على وتيرة ثابتة.
      ملاحظة: يجب ترشيح صبغة ICG بفلتر حقنة 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.

3. ICGA و FA

  1. ضع الماوس على وسادة التدفئة لمنصة التصوير لبدء التصوير.
  2. ضع جسم الماوس بزاوية 45 درجة أمام الكاميرا وقم بتدوير رأسه لأسفل قليلا. هذا يسمح للعصب البصري أن يكون في مركز تركيز الكاميرا.
  3. باستخدام قطعة قطن ، امسح العين برفق لإزالة طبقة قطرات العين المزلقة أو المواد الهلامية على العين التي يتم تصويرها أولا. تأكد من تطبيق قطرات جل التشحيم فور الانتهاء من إجراء التصوير.
    ملاحظة: لا ينصح بترك العين دون تزييت لأكثر من 1 دقيقة أثناء التخدير.
  4. حرك الكاميرا باتجاه عين الماوس. حدد قناة FA من وحدة الاستحواذ. يمكن استخدام التلألؤ المنبعث من قناة FA لوضعه في وسط قرنية الماوس لوضع أسرع.
  5. ضع رأس الماوس بطريقة تتمركز فيها العصب البصري على الشاشة ، مع تجنب الحاجة إلى إمالة منظار العين الماسح بالليزر بزاوية. قم بإجراء تعديلات طفيفة على موضع رأس الماوس لتحقيق المحاذاة المطلوبة.
  6. في وحدة الاستحواذ ، حدد قناة ICGA. تأكد من ضبط شدة الليزر على 100٪ وحدد خيار 55 درجة لمطابقة العدسة المناسبة. وهذا يضمن الإعدادات المثلى لمنظار العين الماسح بالليزر.
    ملاحظة: لمنع التشبع الزائد ، قد يكون من الضروري استخدام كثافة ليزر أقل ، عادة حوالي 25٪ -50٪ ، عند تصوير المرحلة المبكرة. يمكن أن يساعد ضبط شدة الليزر في هذا النطاق في التقاط صور واضحة ودقيقة دون التسبب في التشبع.
  7. عندما تشغل العين الشاشة بأكملها على برنامج التصوير ، قم بإجراء تعديلات على إعدادات الحساسية والتركيز للحصول على أوضح صورة لغشاء CNV.
    1. قم بتدوير الزر الأسود المستدير على وحدة الاستحواذ لضبط حساسية الصورة.
    2. قم بتدوير المقبض الموجود على منظار العين لضبط التركيز. عادة ما يكون التركيز الأمثل لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين باستخدام FA في حدود 35-45 D (الديوبتر). من ناحية أخرى ، فإن التركيز المثالي لتصور المشيمية باستخدام ICGA هو بشكل عام بين 10-15 D.
      ملاحظة: نظرا للأحجام المختلفة لغشاء CNV ، قد يكون من الضروري ضبط التركيز في 10-30 D للحصول على التصوير الأمثل لمورفولوجيا الأوعية الدموية.
  8. بمجرد ضبط التركيز والحساسية لتحقيق أفضل صورة ممكنة ، اضغط على الزر الأسود المستدير في وحدة الاستحواذ لتطبيع الصورة. بمجرد اكتمال التطبيع (تم التقاط جميع الإطارات) ، انقر فوق زر الاكتساب على لوحة الشاشة التي تعمل باللمس لحفظ الصورة. قد يكون من الضروري تحريك الكاميرا لصورة CNV من زوايا مختلفة. يمكن أيضا توجيه الماوس في مواضع مختلفة لتوفير أفضل صورة لآفة CNV.
    ملاحظة: قد يضطر المرء إلى إعادة ضبط تركيز أو موضع منظار العين الماسح بالليزر عند عرض الأوعية الدموية بعيدا عن العصب البصري.
  9. قم بالتبديل مرة أخرى إلى قناة FA باستخدام وحدة الاستحواذ. أكمل نفس الخطوات المذكورة في الخطوات من 3.6 إلى 3.7 لضبط حساسية وتركيز كل صورة لالتقاط تسرب آفة CNV.
    ملاحظة: تأكد من تحديد الحساسية الصحيحة لتجنب التشبع الزائد لتسرب CNV وزيادة منطقة التسرب بشكل مصطنع.
  10. تخيل "المرحلة المبكرة" من ICGA و FA بعد 3-4 دقائق من الحقن.
    ملاحظة: "المرحلة المبكرة" هي الوقت الذي يمكن فيه رؤية الأوعية الدموية المشيمية بوضوح وبشكل واضح. خلال المرحلة المتوسطة ، والتي تحدث عادة بين 4-8 دقائق ، تكون الأوعية الشبكية والمشيمية أكثر تلاشيا وانتشارا. مع بدء المرحلة المتأخرة (>8-10 دقائق) ، تصبح كل من الأوعية المشيمية والشبكية غير قابلة للتمييز. ومع ذلك ، تظهر آفات CNV المفرطة الفلورية أقصى تباين مع الخلفية المتضائلة. هذه التوقيتات المذكورة متغيرة وتعتمد على تركيز وكمية صبغة ICG المحقونة. تميل كمية أكبر من صبغة ICG إلى زيادة الجدول الزمني لكل مرحلة وتوفير أوعية أكثر تميزا. يجب تحديد المرحلة بناء على الميزات الرئيسية المذكورة أعلاه بدلا من الوقت المطلق.
  11. بمجرد الحصول على جميع الصور ، ضع مادة تشحيم أو مرهم جل على عين الماوس وراقب الماوس بعناية على وسادة التدفئة للتعافي. عادة ما يستغرق الماوس 1.5 ساعة للتعافي بشكل كامل.
  12. ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها ومنطقة الاحتجاز المخصصة بمجرد تعافيها تماما من التخدير واستيقاظها.
  13. قبل إيقاف تشغيل نظام التصوير والليزر، قم بتصدير الصور إما كملفات TIFF أو JPEG لتحليلها لاحقا.

4. RPE / المشيمية شقة جبل وتلطيخ

  1. إصلاح العينين في 4 ٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها. اغسل العينين مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. قم بإزالة العدسة والقرنية.
  2. احتضان العينين في محلول مانع (10٪ ألبومين مصل بقري ، 0.6٪ Triton X-100 في PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كرر غسل PBS ثلاث مرات.
  3. احتضان العينين بإيزولكتين GS-IB4 Alexa-flour 568 المترافق والأجسام المضادة للأكتين العضلي المضاد α الملساء (انظر جدول المواد) طوال الليل في محلول الحظر.
  4. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من Alexa Fluor 488 (انظر جدول المواد) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. أداء 4 تخفيضات شعاعي من الحافة إلى خط الاستواء. إزالة بعناية شبكية العين17.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لضمان عدم انفصال الغشاء الوعائي الحديث عن طريق الخطأ.
  6. قم بتركيب المشيمية المثبتة بشكل مسطح على شريحة زجاجية. تصور CNV باستخدام المجهر متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول ، تم إجراء ICGA و FA على CNV المستحث بالليزر في الفئران الصغيرة (7-9 أسابيع) والقديمة (12-16 شهرا) C57BL / 6J. يوفر FA معلومات حول موقع وتسرب آفات CNV (الشكل 1 ، اللوحات اليسرى) ، بينما يكشف ICGA عن مورفولوجيا الأوعية الدموية لآفات CNV (الشكل 1 ، اللوحات اليمنى). في الفئران الصغيرة ، يهيمن CNV الشعري على آفات CNV. في المقابل ، تظهر الفئران القديمة CNV الشرياني الذي يتميز بأوعية ذات عيار كبير وحلقات وعائية ووصلات مفاغرة. تظهر كل من الفئران الصغيرة والكبيرة رؤية واضحة للأوعية الدموية في شبكية العين في FA (الشكل 1 ، اللوحات اليسرى). في صور ICGA للفئران الصغيرة ، لا تكون الأوعية الدموية في شبكية العين مرئية ، وتظهر الأوعية المشيمية باهتة ، مما يشير إلى المرحلة الوسطى من ICGA مع التركيز على الأوعية الدموية المشيمية. في صور ICGA للفئران القديمة ، يمكن ملاحظة الأوعية الدموية الجزئية في شبكية العين بينما تبدو الأوعية المشيمية باهتة ، مما يشير إلى المرحلة الوسطى مع التركيز بين الشبكية والمشيمية بسبب الحجم الأكبر ل CNV الشرياني في الفئران القديمة. يظهر CNV الشرياني في الفئران القديمة حجم CNV أكبر (الشكل 2) وتسرب أكبر بكثير مقارنة ب CNV الشعري في الفئران الصغيرة. إن التلوين المناعي بجسم مضاد للأكتين العضلي المضاد للبقع يسمي على نطاق واسع الأوعية الدموية CNV في الفئران القديمة ، مما يؤكد التشكل الشرياني (الشكل 3). في المقابل ، لوحظ الحد الأدنى من تلطيخ الأكتين العضلي α الملساء في الأوعية الدموية لموقع الآفة للفئران الصغيرة ، بما يتفق مع مورفولوجيا الشعيرات الدموية.

Figure 1
الشكل 1: مقارنة بين صور FA و ICGA التي تصور CNV المستحث بالليزر في الفئران الصغيرة والكبيرة. تعرض صور FA تسرب آفات CNV ، بينما توفر ICGA تصورا لمورفولوجيا الأوعية الدموية. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: القياس الكمي لحجم آفة CNV في الفئران الصغيرة والكبيرة بناء على صور ICGA. تم قياس مناطق CNV ، مع تحليل ما مجموعه 26 و 14 بقعة ليزر في الفئران الصغيرة والكبيرة ، على التوالي. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. P < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية لآفات CNV في الفئران الصغيرة والكبيرة ، تم تصنيفها بشكل مشترك مع Alexa 568 isolectin والجسم المضاد للأكتين العضلي المضاد α الملساء على حوامل مسطحة RPE / المشيمية. يمثل اللون الأحمر Alexa 568 isolectin ، بينما يمثل اللون الأخضر أكتين العضلات α الملساء (SMA). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أظهرت هذه الدراسة استخدام تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين (ICGA) لتحديد مورفولوجيا الأوعية الدموية للأوعية الدموية المشيمية الشريانية والشعرية (CNV) في نماذج الفئران مع CNV الناجم عن الليزر. مكنت خصائص ضوء الهيموغلوبين والأشعة تحت الحمراء لصبغة الإندوسيانين الخضراء (ICG) من اكتشاف مورفولوجيا CNV ، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) ، وهي الطريقة الحالية التي يستخدمها مجتمع البحث.

الخطوة الأولى الحاسمة في البروتوكول هي التأكد من حقن الصبغة في التجويف داخل الصفاق دون اختراق الأعضاء. يسمح وضع الحقن المناسب في الربع السفلي الأيسر ، بزاوية صغيرة بين الجلد والشطبة ، مع تجنب إدخال الإبرة بأكملها ، بتحسين امتصاص صبغة الإندوسيانين. يمكن أن يؤدي حقن الصبغة في العضو إلى امتصاص أبطأ ومضاعفات محتملة مثل تمزق أعضاء البطن أو النزيف الداخلي أو العدوى. جانب رئيسي آخر من الإجراء هو توسيط العصب البصري قبل التقاط الصور لعرض قطر العين بالكامل. يتطلب ذلك تداخل التلألؤ المنبعث من قناة FA وعين الماوس مع الانتباه إلى الصورة على شاشة الكمبيوتر. لإصلاح الزاوية الطولية ، من الأفضل إمالة رأس الماوس مباشرة في مكانه بدلا من ضبط الجهاز لأعلى أو لأسفل ، مما يضمن التقاط مجال الرؤية الكامل.

أظهرت الأبحاث السابقة أن استخدام مخدر الكيتامين / الزيلازين يمكن أن يسبب عتامة القرنية18,19. يمكن التقليل من ذلك عن طريق تقليل كمية الزيلازين20. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم الحفاظ على رطوبة القرنية ثابتة لتجنب تكوين إعتام عدسة العين. يمكن تحقيق ذلك باستخدام قطرات العين أو الجل التشحيم. تصبح هذه العوامل مهمة بشكل خاص مع زيادة وتيرة التصوير وشيخوخة النموذج الحيواني ، حيث يؤثر تلف القرنية المستمر على وضوح صور ICGA. لفترات التصوير الطويلة ، يمكن تعديل الإجراء عن طريق استخدام عدسة لاصقة بولي ميثيل ميثاكريلات فوق محلول عازل قائم على الهلام لمنع تكوين إعتام عدسة العين21.

طريقة الحقن هي عنصر حاسم آخر. بينما تركز هذه الدراسة على الحقن داخل الصفاق (IP) ، يمكن إجراء تعديلات طفيفة باستخدام الحقن في الوريد (IV) ، وتحديدا حقن الوريد الذيل. تم اختيار الحقن داخل الصفاق بسبب سهولة إنجازه ، خاصة مع الفئران المصطبغة ، وموثوقيته أثناء العملية. هذا اعتبار مهم لأن التجارب الكمية على CNV تتطلب معالجة فعالة لأعداد كبيرة من الفئران. بغض النظر عن طريقة الحقن ، لا يزال من الممكن الحصول على ميزات تصوير الأوعية الدموية ل CNV نظرا لحجمها الكبير وموقعها بين المشيمية والشبكية عند توصيف أنواع مختلفة من الآفات المشيمية في نموذج حيواني. ومع ذلك ، يختلف هذا بالنسبة لاعتلال الأوعية الدموية المشيمية متعدد الأضلاع (PCV) ، وهو نوع فرعي آخر من AMD الرطب ، والذي يقع بشكل أساسي داخل المشيمية ويتطلب تصويرا للدورة الزمنية IV-ICGA للتشخيص الدقيق22.

أحد قيود FA / ICGA مجتمعة هو التباين المتزايد عند التقاط مراحل مختلفة من نضح CNV. لا تتوافق التوقيتات المثلى للمراحل المبكرة والمتأخرة دائما مع صور ICGA و FA المثالية ، مما يتطلب وقتا إضافيا لضبط التركيز بين الوضعين لكل عين. يتم تضخيم هذا الجانب من خلال إجراء حقن IP ، والذي يقدم المزيد من التباين في توقيت المراحل الثلاث ويستلزم وقت تصوير أطول مقارنة بحقن الوريدالخلفي 22. ومع ذلك ، فإن هذه العوامل لها تأثير ضئيل على اكتشاف مورفولوجيا الأوعية الدموية CNV ، وفوائد FA / ICGA مجتمعة تفوق هذه القيود.

تشير الدراسات الحديثة إلى أن أنواعا مختلفة من آفات CNV ، مثل CNV الشعرية أو الشريانية ، تستجيب بشكل مختلف للعلاجات الحالية المضادة ل VEGF9،16،17. لذلك ، فإن تحديد مورفولوجيا الأوعية الدموية لآفات CNV أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك ، فإن طريقة الاختيار الحالية ، FA ، لا توفر هذه المعلومات الأساسية. يوصى باستخدام ICGA في مجتمع البحث لتصوير نماذج AMD الوعائية الجديدة. أظهرت هذه الدراسة أنه يمكن إجراء ICGA و FA معا بشكل ملائم لتقييم كل من التسرب والسمات الوعائية ل CNV للدراسات الميكانيكية والعلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة BrightFocus ، ومؤسسة أبحاث شبكية العين ، ومؤسسة Mullen ، ووقف سارة كامبل بلافر في طب العيون إلى YF ، والمنحة الأساسية للمعاهد الوطنية للصحة 2P30EY002520 إلى كلية بايلور للطب ، ومنحة غير مقيدة لقسم طب العيون في كلية بايلور للطب من الأبحاث للوقاية من العمى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32-G Insulin Syringe MHC Medical Products NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11008
Anti-α smooth muscle Actin antibody Abcam ab5694
Bovine Serum Albumin Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-2323 
C57BL/6J mice (7-9 weeks) The Jackson Laboratory Strain #:000664
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich MFCD00167039
Gaymar T Pump Heat Therapy System Gaymar TP-500 Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging
GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 Clear lubricant eye gel
GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate Invitrogen  I21412
Heidelberg Eye Explorerer Heidelberg Engineering, Germany HEYEX2
Indocyanine Green Pfaultz & Bauer I01250
Ketamine Vedco Inc. NDC 50989-996-06
Paraformaldehyde Acros Organics  416785000
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) Sandoz NDC 61314-016-01
Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100-1L
Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 For dilation of pupils
Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  3. Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
  4. Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
  5. Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), London, England. 538-545 (2014).
  6. Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
  7. Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
  8. Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
  9. Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
  10. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
  11. Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
  12. Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
  13. Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
  14. Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
  15. Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
  16. Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
  17. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  18. Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
  19. Li, X. -T., Qin, Y., Zhao, J. -Y., Zhang, J. -S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
  20. Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
  21. Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
  22. Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).

Tags

مورفولوجيا الأوعية الدموية ، التنكس البقعي المرتبط بالعمر الوعائي الحديث ، تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين ، AMD ، التوعي المشيمي ، AMD الرطب ، العلاجات المضادة ل VEGF ، مقاومة العلاج ، CNV الشرياني ، CNV الشعري ، تصوير الأوعية الدموية بالفلوريسئين ، أنماط التسرب ، نماذج ماوس CNV الناجم عن الليزر ، الآليات واستراتيجيات العلاج
توصيف مورفولوجيا الأوعية الدموية للتنكس البقعي المرتبط بالعمر الوعائي الحديث بواسطة تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Attarde, A., Riad, T. S., Zhang, Z., … More

Attarde, A., Riad, T. S., Zhang, Z., Ahir, M., Fu, Y. Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography. J. Vis. Exp. (198), e65682, doi:10.3791/65682 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter