Summary
우리는 유전자 조작 쥐의 신경계 신생물이 인간 쥐의 병리를 정확하게 재현하는지 여부를 평가하는 방법론을 개발했습니다. 여기서는 이러한 조직학적 기술, 정의된 병리학적 기준 및 배양 방법론을 P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 발생하는 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양에 적용합니다.
Abstract
상염색체 우성 종양 감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1) 환자는 일반적으로 망상신경섬유종(PN)이 발생하며, 이후 매우 공격적인 악성 말초 신경초초 종양(MPNST)으로 변합니다. PN이 MPNST로 전환되는 과정을 이해하는 것은 NF1이 있는 인간에게서 볼 수 있는 PN-MPNST 진행을 정확하게 복제하는 유전자 조작 마우스(GEM) 모델의 가용성에 의해 촉진될 것입니다. 불행히도 Nf1 절제가 있는 GEM 모델은 이 프로세스를 완전히 재현하지 못합니다. 이를 통해 슈반(Schwann) 세포에서 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)이 과발현되어 고주파의 MPNST로 발전하는 PN이 발생하는 GEM 모델인 P 0-GGFβ3 마우스를 개발하게 되었습니다. 그러나 P 0-GGFβ3 마우스의 종양형성 및 종양 진행이 NF1 환자에서 관찰되는 과정을 정확하게 모델링하는지 여부를 결정하기 위해서는 먼저 P0-GGFβ3 말초 신경초 종양의 병리학이 인간 종양의 병리를 재현한다는 것을 증명해야 했습니다.
여기에서는 P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 사용하여 GEM 모델에서 말초 신경계 신생물을 정확하게 진단하고 등급을 매기는 데 사용되는 특수 방법론을 설명합니다. Trp53+/- 마우스를 예로 들 수 있습니다. PN 및 MPNST를 진단하는 데 사용되는 조직학적, 면역조직화학적, 조직화학적 방법, 이러한 신생물을 병리학을 모방하는 다른 종양 유형과 구별하는 방법 및 이러한 신생물의 등급을 매기는 방법에 대해 설명합니다. GEM MPNST의 초기 배양 확립, 면역세포화학을 사용하여 이러한 배양을 특성화하는 방법, 동종 이식편을 설정하여 종양원성을 검증하는 방법에 대해 논의합니다. 종합적으로 이러한 기술은 GEM 모델에서 발생하는 PN 및 MPNST의 병리를 특성화하고 이러한 쥐 종양의 병리학을 인간 종양과 비판적으로 비교합니다.
Introduction
지난 30년 동안 수많은 실험실에서 인간 암 관련 돌연변이를 마우스 게놈에 도입하거나 인간 암에서 과발현되는 유전자 산물을 과발현하여 인간 암의 마우스 모델을 만들려고 시도했습니다. 그 결과 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 새로 도입된 게놈 변형이 종양 형성을 시작한다는 것을 확립하고, 종양 진행에 기여하는 다른 후속 유전적 또는 후성유전학적 변화를 식별하고, 종양 시작 및 진행을 유도하는 주요 신호 전달 경로를 정의하는 등 다양한 목적으로 사용할 수 있습니다. 면역 결핍 마우스의 사용에 의존하는 orthotopic 이종이식 모델과 달리 GEM 암 모델은 완전한 기능을 갖춘 면역 체계를 가지고 있으므로 후보 치료제에 대한 반응을 보다 정확하게 모델링할 수 있습니다. 그러나 이와 같은 목적으로 GEM 암 모델을 사용할 때는 조사관이 GEM 신생물로 관찰한 것이 인간 신생물과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 검증에는 GEM 신생물의 병리학에 대한 철저한 평가와 GEM 신생물의 병리학적 특징이 해당 인간 종양 유형의 병리를 재현하는지 여부에 대한 결정이 포함되어야 합니다.
종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1)은 인간 신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 유전 질환으로, 출생아 3,000-3,500명당 약 1명꼴로 발생합니다 1,2,3. NF1에 감염된 개인은 피부(피부 신경 섬유종)와 큰 신경 및 신경총(망상 신경 섬유종)에 신경 섬유종으로 알려진 여러 양성 말초 신경초 종양이 발생합니다. 진피 신경섬유종과 망상신경섬유종은 모두 신체적, 행동적, 사회적 장애를 일으켜 환자의 삶의 질을 악화시키지만, 망상신경섬유종(PN)은 특히 위험하다 4,5. 이는 PN이 생존율이 매우 낮은 공격적인 방추세포 신생물인 악성 말초신경초종양(MPNST)으로 자주 변형되기 때문입니다 1,2. 이러한 낮은 생존율은 대부분 현재 MPNST를 치료하는 데 사용되는 방사선 및 화학 요법이 효과가 없기 때문입니다. 그러나 새롭고 더 효과적인 치료법을 개발하는 것은 어려운 일이었습니다. 이는 NF1 환자에서 MPNST가 얼마나 흔하게 발생하는지에도 불구하고 여전히 희귀한 신생물이기 때문입니다. 결과적으로, 연구를 위해 많은 수의 인간 종양을 얻는 것은 매우 어렵습니다. 임상시험을 위해 MPNST를 가진 충분한 환자를 모집하는 것도 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경섬유종 발병기전 및 PN-MPNST 진행을 유발하는 이상에 대한 추가 통찰력을 얻고 후보 치료제에 대한 전임상 시험을 촉진하는 것을 목표로 여러 GEM 모델이 생성되었습니다.
NF1 환자는 NF1 유전자의 한 사본에 불활성화 돌연변이가 있습니다. 신경섬유종 발병기전은 Schwann 세포 계통의 세포에서 나머지 기능적 NF1 유전자의 불활성화 돌연변이가 발생할 때 유발됩니다. 그러나 놀랍게도, 생식세포가 Nf1 돌연변이를 비활성화한 마우스를 생성했을 때, 그들은 신경섬유종 6,7을 개발하지 않았다. 다른 모든 세포 유형에서 Nf1-null Schwann 세포 및 Nf1 하플로불충분을 가진 마우스(Krox20-Cre;Nf1flox/- 마우스)가 발달한 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibromas)은 신경섬유종 발병기전을 위해 추가적인 세포 유형에서 감소된 Nf1 유전자 투여량이 필요하다는 것을 시사했다8. 그럼에도 불구하고 Krox20-Cre의 망상 신경 섬유종; Nf1flox/- 마우스는 MPNST로 진행되지 않았으므로 인간 마우스의 생물학을 부분적으로만 모방했습니다. MPNST 발병기전은 Nf1 돌연변이가 Trp539 또는 Cdkn2a10과 같은 추가 종양 억제 유전자의 돌연변이와 짝을 이룰 때 발생했지만, 이러한 GEM 모델의 MPNST는 기존의 양성 신경총형 신경섬유종(benign plexiform neurofibromas)이 아닌 불확실한 생물학적 전위(ANNUBP)의 비정형 신경섬유종 신생물(atypical neurofibromatous neoplasm)에서 발생하거나 발생했다(13,14 참조). Suz12 및 Pten15와 같은 유전자에서 추가적인 MPNST 관련 기능 돌연변이를 도입하는 다른 모델뿐만 아니라 이러한 모델에 대한 우수한 검토를 위해).
이러한 마우스 모델은 NF1, TP53 및 CDKN2A와 같은 유전자가 NF1 관련 말초 신경계 신생물의 발병기전에서 수행하는 역할을 규명하고 후보 치료제를 테스트하는 전임상 시험에 매우 중요합니다. 그러나 우리는 여전히 망상형 신경섬유종이 불확실한 생물학적 잠재력(ANNUBPs16)의 비정형 신경섬유종성 신생물이 된 다음 MPNST가 되는 과정에 대해 불완전하게 이해하고 있습니다. Nf1 및 Arf에서 결실이 있는 마우스가 MPNST로 진행되는 ANNUBP를 개발한다는 최근 보고와 함께 이 과정을 이해하는 데 약간의 진전이 있었습니다11. 그러나 인간에서 볼 수 있는 망상형 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 완전히 재현하는 Nf1 돌연변이 기반 마우스 모델은 아직 존재하지 않습니다. 또한 MPNST의 개발로 이어지는 여러 가지 뚜렷한 경로가 있는지 여부도 명확하지 않습니다. 이를 감안할 때, 위에서 설명한 GEM은 신경섬유종-MPNST 진행 및 MPNST 발병기전으로 이어지는 여러 다른 경로의 하위 집합만 모델링할 수 있습니다. 이 점은 MPNST가 또한 산발적으로 발생한다는 사실과 일부 산발적인 MPNST는 명백히 NF1 돌연변이를 가지고 있지 않다는 사실에 의해 강조된다17,18.
NF1 돌연변이가 결핍된 적어도 일부 산발성 MPNST는 흑색종 또는 다른 유형의 육종이라는 Magollon-Lorenz et al.의 최근 제안에 의해 이 후자의 주장에 도전받았지만, 우리는 최근에 산발적인 MPNST와 NF1 야생형20인 이 종양(2XSB 세포)에서 유래한 세포주를 보고했습니다. 모종양과 2XSB 세포주를 특성화하는 동안, 흑색종 및 산발성 악성 말초신경초 종양의 감별 진단에서 일상적으로 고려되는 여러 다른 육종 유형을 포함한 대체 진단 가능성을 체계적으로 배제했다20. 또한, Magollon-Lorenz 등은 그들이 연구한 3개의 산발적인 MPNST 세포주에서 발견한 결과가 산발성 MPNST로 확인된 모든 종양이 MPNST가 아니라는 것을 나타내기 위해 일반화할 수 없다는 것을 인정했습니다.
신경섬유종과 MPNST 발병기전이 특정 종양 억제 유전자 돌연변이에 반드시 의존하지 않는 GEM 모델을 구축하기 위해, 슈반(Schwann) 세포 특이적 미엘린 단백질 제로(P0) 프로모터(P 0-GGFβ3 마우스)에 의해 강력한 슈반(Schwann) 세포 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)의 과발현이 유도되는 형질전환 마우스를 생성했습니다.21. 우리는 이전에 인간 신경섬유종, MPNST 및 MPNST 세포주가 NRG1 신호전달을 매개하는 erbB 수용체 티로신 키나아제(erbB2, erbB3 및 erbB4)와 함께 여러 NRG1 동형을 발현하고 이러한 erbB 수용체가 구성적으로 활성화됨을 보여주었습니다22. 또한 erbB 키나아제의 약리학적 억제제가 MPNST 증식22, 생존23 및 이동을 강력하게 억제한다는 것을 입증했다24. 인간에 대한 우리의 관찰에 따라, P 0-GGFβ3 마우스는 고주파 21,25에서 MPNST로 진행되는 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibroma)25을 발달시킨다. P0-GGFβ3 MPNST는 인간과 마찬가지로 일반적으로 Trp53 및 Cdkn2a의 돌연변이뿐만 아니라 종양형성에 잠재적으로 기여할 수 있는 수많은 다른 유전체 이상을 발생시킨다는 것을 보여주었다25. P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 MPNST는 비활성화 Nf1 돌연변이를 갖지 않습니다. 그러나, 유전자 보완을 이용하여, NRG1이 Nf1 손실에 의해 변경되는 동일한 신호전달 캐스케이드를 통해 주로 P 0-GGFβ3 마우스에서 종양형성을 촉진한다는 것을 보여주었다26; 이 결론은 Trp53 하플로인부전(haploinsufficiency)이 있는 상태에서 Nf1 손실을 NRG1 과발현으로 대체한다는 우리의 발견에 근거한다(P0-GGFβ3;Trp53+/- 마우스)는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있듯이 MPNST가 de novo로 발달하는 동물을 생산합니다. Trp53+/- 마우스27.
P 0-GGFβ3 마우스가 NF1을 가진 인간에서 볼 수 있는 신경섬유종 발병 및 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 정확하게 모델링한다는 것을 입증하는 이 정보와 기타 정보를 얻기 위해 당사는 이러한 동물의 조직을 처리하고, 종양을 정확하게 진단하고, 이러한 마우스에서 발생하는 MPNST의 등급을 매기고, 초기 통과 P0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 확립하고 특성화하는 특수 방법론을 개발했습니다. Trp53+/- MPNST 배양 및 P 0-GGFβ3 PN 및 MPNST와 P0-GGFβ3의 병리학을 비판적으로 비교; Trp53+/- MPNST를 인간과 비교합니다. 이러한 방법론 중 다수는 신경계 종양의 다른 GEM 모델로 일반화할 수 있습니다. 또한 이러한 방법론 중 일부는 다른 장기 부위에서 신생물이 발생하는 GEM 모델에 더 광범위하게 적용할 수 있습니다. 따라서 여기서는 이러한 방법론에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명된 절차는 사우스캐롤라이나 의과대학의 IACUC의 승인을 받았으며 NIH 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 및 MUSC의 기관 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련된 직원이 수행했습니다.
1. P 0-GGFβ3 마우스의 종양 침투 및 생존 결정 및 추가 특성 분석을 위한 이러한 동물의 종양 식별
- 종양 형성에 대해 평가할 마우스 코호트를 생성합니다. 필요한 마우스의 수는 종양 표현형의 침투도에 따라 다릅니다. 이와 같은 손실을 보상하려면 원하는 최종 동물 수보다 10-15% 더 높은 코호트로 시작하십시오.
참고: 50마리의 마우스로 구성된 초기 코호트에서 P 0-GGFβ3 마우스의 종양 침투율을 경험적으로 측정했습니다(이 중 6개는 신생물과 관련이 없는 이유(예: 싸움)로 손실됨)25. - 일주일에 세 번 동물의 건강을 평가하고 각 검사에서 체중 및 행동 변화를 포함한 신체 상태 점수를 기록합니다. 종양이 있거나 죽은 쥐(아래 참고 참조)를 이산화탄소 안락사 후 자궁경부 탈구를 사용하여 제거한다. 사망 시 나이를 며칠 단위로 기록합니다. 종양이 외부에서 보이는 경우 종양 치수(길이, 너비 및 높이)를 기록합니다.
참고: 동물은 IACUC가 승인한 최대 허용 종양 크기 및/또는 인도적 종점을 초과하여 진행해서는 안 됩니다. - 사망 시 연령을 사용하여 Kaplan-Meier 생존 곡선을 설정하여 평균 사망 연령과 생존 범위를 결정합니다.
참고: P 0-GGFβ3 마우스의 평균 사망 연령은 261.5일, 범위는 74-533일이었습니다. 코호트의 91%는 다발성 신경섬유종을 가지고 있었고 71%는 MPNST를 가지고 있었다21. - 눈에 잘 띄는 종양이 있는지 확인하고, 있는 경우 무균 상태에서 종양을 절개하여 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 확인한 다음 종양을 절제합니다. P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3에서; Trp53+/- 마우스, 말초 신경초 종양은 삼차 신경과 좌골 신경에서 가장 흔하게 발견됩니다. 이러한 신경과 관련하여 눈에 잘 띄는 종양이 보이지 않더라도 아래에 설명된 대로 이러한 신경을 고정하고 매립하여 미세 종양의 존재 여부를 검사할 수 있습니다. 미세 종양은 일반적으로 이러한 신경과 관련된 신경절 내에서 발생합니다.
- 눈에 잘 띄는 종양을 세 조각으로 자릅니다(그림 1A). 조직학(파라핀 절편, 면역조직화학 및 조직화학)을 위해 1편을 사용합니다. 조각 2를 사용하여 초기 통로 문화를 확립하십시오. 가능한 향후 실험(예: 면역 블록, RNA 및 DNA 분리)을 위한 스냅 동결 조각 3(액체 질소 사용).
- 4% 파라포름알데히드를 4 °C에서밤새 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드에 담가 나머지 부분을 고정합니다.
2. 심하게 보이는 종양의 파라핀 포매 및 초기 진단 평가를 위한 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편 준비
- 심하게 보이는 종양의 파라핀 삽입
- 4% 파라포름알데히드에 종양 조각 1을 밤새 고정한 후 15분 동안 조직 부피보다 10배 이상 큰 PBS 부피에 넣어 조직을 헹굽니다. 이후의 모든 헹굼에 동일한 양을 사용하십시오. 헹굴 때마다 새로운 양의 PBS를 사용하여 15분 PBS 헹굼을 두 번 더 반복합니다.
- 종양 조각 1을 70% 에탄올로 옮깁니다. 조직을 70% 에탄올에 넣고 4°C에서 24시간 동안 유지합니다. 원하는 경우 이러한 조건에서 조직을 장기간 보관하십시오.
참고: 2.1.1단계부터 2.1.7단계까지는 상업용 조직 처리 기계에 접근할 수 없는 연구자를 위해 제공됩니다. 연구자가 조직 처리기에 접근할 수 있는 경우 조직은 프로그래밍된 기기 프로토콜에 따라 등급이 매겨진 에탄올과 크실렌을 통해 처리됩니다. - 종양 조각 1을 80% 에탄올로 실온에서 30분 동안 옮깁니다. 80% 에탄올의 신선한 부피에서 추가로 30분 동안 배양을 반복합니다.
- 종양 조각 1을 95% 에탄올로 실온에서 75분 동안 옮깁니다. 배양을 두 번 더 반복하고, 매번 95% 에탄올의 신선한 부피에서 추가로 75분 동안 반복합니다.
- 종양 조각 1을 100% 에탄올로 옮기고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 60분 배양을 두 번 더 반복하되 매번 100% 에탄올을 새로 사용합니다.
- 종양 조각 1을 d-리모넨 기반 용매로 옮기고 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 종양 조각 1을 d-리모넨 기반 용매의 새로운 부피로 옮기고 실온에서 추가로 30-60분 동안 배양합니다.
- 종양 조각 1을 1:1 파라핀/d-리모넨계 용매에 60°C에서1시간 동안 옮깁니다. 1:1 파라핀/d-리모넨계 용매를 버리고 종양 조각 1을 60°C 파라핀으로 옮기고 60°C에서 20분 동안 배양합니다. 종양 조각 1을 60oC에서 밤새 파라핀에 배양합니다.
- 파라핀의 기본 층을 강철 조직학 주형에 붓고 응고시킵니다. 종양 조각 1을 베이스 파라핀의 표면으로 옮기고 위치 지정 직후 조직을 60oC 파라핀으로 덮고 조직 카세트를 용융된 파라핀 위에 놓고 접촉시킵니다. 몰드를 임베딩 스테이션의 차가운 쪽으로 옮기고 10-15분 동안 응고시킵니다.
- 티슈 카세트가 부착된 파라핀 블록을 금형에서 제거합니다. 부착된 티슈 카세트를 사용하여 절편하는 동안 블록을 마이크로톰에 고정합니다.
알림: 파라핀 블록은 이제 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
- 심하게 보이는 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편을 준비합니다.
- 마이크로톰을 사용하여 종양 조직의 4-5μm 절편을 잘라내고 양전하를 띤 유리 슬라이드에 장착합니다.
- 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하려면 실온에서 10분 동안 d-리모넨 기반 용매에 슬라이드를 배양하여 조직 절편을 탈파라핀화합니다. d-리모넨 기반 용매의 새로운 부피에서 10분 동안 배양을 반복합니다.
- 슬라이드를 100% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 슬라이드를 100% 에탄올의 신선한 부피로 옮기고 실온에서 5분 더 배양합니다.
- 슬라이드를 95% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 슬라이드를 95% 에탄올의 새로운 부피로 옮기고 실온에서 5분 더 배양합니다.
- 슬라이드를 70% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 50% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 증류수로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 실온에서 5분 동안 헤마톡실린에 담가 염색합니다. 흐르는 수돗물로 1-2분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 70% 에탄올에 0.5% 염산에 2-5배 담궈서 분화합니다. 흐르는 수돗물에서 1-2분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 95% 에탄올과 0.5% 아세트산에 10초 동안 넣습니다.
- 실온에서 30초 동안 에오신-Y로 슬라이드를 염색한 다음 슬라이드를 5분 동안 100% 에탄올로 옮깁니다. d-리모넨 기반 용매에서 5분 동안 샘플을 투명화합니다.
- 슬라이드가 d-리모넨 기반 용매로 젖어 있는 동안 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다. 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
알림: 수성 장착 매체 를 사용하지 마십시오 .
- 망상형 신경섬유종과 마이크로 MPNST를 식별하기 위해 심하게 보이는 종양이 없는 조직을 준비합니다. 조직을 파라핀에 삽입하고, 조직학적 절편을 준비하고, 이 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색합니다.
- 내부 장기를 제거하고 각 장기의 대표 부분을 파라핀에 삽입하여 종양의 현미경적 증거를 검사할 H&E 염색 절편을 준비합니다(그림 1B). 머리, 앞다리, 뒷다리 및 꼬리를 제거합니다(그림 1C). 신경근 종양의 증거를 찾기 위해 척수와 신경근을 제자리에서 검사하려면 4oC에서 0.3-72시간 동안 0.3M EDTA/4% 파라포름알데히(pH 8.0)에 담가 척추 기둥과 관련 갈비뼈 및 연조직을 석회질화합니다. 그런 다음 샘플을 1x PBS로 헹굽니다. 석회질 제거가 끝나면 바늘로 척추를 뚫어 석회질 제거가 완료되었는지 확인합니다. 석회질 제거는 바늘이 으스러지지 않고 뼈에 쉽게 침투하면 성공적입니다.
- 석회질이 제거된 척추 기둥과 관련 구조물을 조직 카세트에 맞는 블록으로 자릅니다. 2.1.2-2.1.7 단계에 설명된 대로 등급이 매겨진 에탄올을 통해 탈수한 후 d-리모넨 기반 용매를 사용합니다. 파라핀에 삽입하고 2.1.7-2.2.1단계에 설명된 대로 4-5μm 절편을 준비합니다. 2.2.2-2.2.9 단계에 설명된 대로 H&E 염색을 수행합니다. 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
3. 잠재적인 망상형 신경섬유종을 식별하고 진단을 확인하기 위해 특수 염색을 수행합니다.
참고: H&E 및 GEM 종양 절편의 특수 염색 평가에 숙련된 인간 또는 수의학 병리학자를 포함할 것을 강력히 권장합니다.
- 명시야 현미경을 사용하여 위에서 설명한 대로 준비된 H&E 염색 슬라이드를 검사하여 잠재적인 말초 신경초 종양을 식별합니다. 신경섬유종과 MPNST는 말초 신경 내에서 발생하기 때문에 미세한 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 잠재적인 말초 신경초 종양이 있는 블록을 식별하여 면역염색 및 기타 특수 염색을 수행하여 진단을 확인하거나 반박할 수 있습니다.
- H&E 염색 절편의 명시야 검사 중에 관찰된 조직학적 특징을 기반으로 잠재적인 PN을 MPNST/기타 고급 신생물과 구별합니다. 인간 PN은 주로 길쭉하고 종종 물결 모양의 핵을 가진 세포로 구성된 약한 과세포 신생물입니다. 많은 영역에서, 세포는 느슨하게 포장되어 있으며 점액성 세포외 물질에 의해 분리될 수 있습니다. P 0-GGFβ3 마우스의 PN은 유사한 모양을 가지고 있습니다. 유사 분열은 전형적으로 존재하지 않습니다; 종양이 중등도에서 고도의 과세포성인 경우, 종양은 MPNST 또는 다른 유형의 고급 신생물입니다(아래 참조).
- PN은 종양성 슈반(neoplastic Schwann) 세포와 비만세포(mast cell)와 같은 다른 비종양 세포 유형의 혼합물로 구성됩니다. PN의 정체를 확인하려면 H&E 검사에서 식별된 잠재적 PN이 포함된 블록의 절편에서 Schwann 세포 마커 S100β 및 Sox10과 비만 세포 마커 CD117(c-Kit)에 대한 면역염색을 수행합니다(대체 비만세포 마커 염색 옵션은 섹션 3.4 참조). Ki67 면역염색을 수행하여 낮은 증식률을 확인합니다.
참고: 표 1 은 GEM 망상형 신경섬유종(S100β, Sox10, CD117, Ki67)의 일상적인 식별, MPNST의 진단 및 신경섬유종에 존재하는 다른 세포 유형의 완전한 평가에 사용되는 항원 마커를 나열합니다. 우리는 새로운 GEM 모델을 처음 설명할 때만 이러한 후자의 항원에 대해 염색합니다. 권장 조건에 대해서는 항체 제조업체의 데이터시트를 참조하십시오. 항체 제조업체의 삽입물이 항원 회수를 권장하는지 여부를 확인하십시오. 모든 항원을 검출하기 위해 회수가 필요한 것은 아닙니다.- 선택한 파라핀 블록에서 4-5μm 절편을 준비하고 양전하를 띤 슬라이드에 장착합니다. 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 섹션을 분리합니다.
- 1x PBS로 3-5분 동안 섹션을 헹굽니다.
- 항체 제조업체가 항원 회수를 권장하는 경우 구연산염 완충액을 준비합니다. 구연산 용액 9mL(증류수 500mL에 구연산 10.5g)와 구연산나트륨 용액 41mL(증류수 500mL에 구연산나트륨 14.7g)를 혼합합니다.
- 가열된 밥솥에서 20분 동안 구연산염 완충액에 슬라이드를 넣어 항원 검색을 수행합니다.
- 슬라이드를 3% 과산화수소/1x PBS로 10분 동안 옮겨 조직의 과산화효소 활성을 제거합니다.
알림: 이 용액을 매번 신선하게 만들고 과산화수소 원액이 3-4개월 이상 된 경우 사용하지 마십시오. - 1x PBS에서 섹션을 헹굽니다.
- 차단 완충액(2x PBS에서 0.1% BSA, 100% Triton X-1)을 사용하여 1시간 동안 섹션을 차단합니다. 1x PBS에서 슬라이드를 짧게 헹굽니다.
- 조직 절편에 1차 항체를 추가합니다. 희석된 차단 완충액에 1차 항체를 준비합니다. 37 oC에서 2 시간 동안 또는 4 oC에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
- 1x PBS에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 3회 반복합니다.
- 비오틴화된 2차 항체로 조직을 1-2시간 동안 배양합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 디아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비하고 슬라이드를 용액에 2-10분 동안 담급니다. 슬라이드를 물에 5분 동안 씻습니다.
- 섹션을 헤마톡실린에 10-15분 동안 담가 대조염색합니다. 맑아질 때까지 흐르는 물에 노출시키십시오. 슬라이드를 알코올에 빠르게 담그고 슬라이드를 물로 헹굽니다.
- 70% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올에 용액당 4-5회 슬라이드를 빠르게 담궈 등급이 매겨진 에탄올의 슬라이드를 탈수합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매에서 2분 동안 배양합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매의 두 번째 배치에서 2분 동안 배양합니다.
- 크실렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다.
- 명시야 현미경으로 슬라이드를 검사합니다.
- 면역형광의 경우 3.3.10-3.3.15단계를 생략합니다. 대신, 차단 완충액에 희석된 종 특이적 2차 항체로 조직을 1-2시간 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 1x PBS에서 5분 동안 헹굽니다. 3x 반복합니다.
- 1x PBS/글리세롤을 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다.
- 비만세포 염색을 위한 대체 방법: 톨루이딘 블루 염색
- 톨루이딘 블루 O 1g을 70% 에탄올 100mL에 녹여 톨루이딘 블루 원액을 준비합니다.
- 1mL의 증류수에 0.5g의 NaCl을 녹여 50% 염화나트륨(NaCl) 용액을 준비합니다. 섞어서 녹입니다. HCl을 사용하여 pH를 약 2.0-2.5로 조정합니다.
알림: 이 NaCl 용액은 얼룩이 수행될 때마다 신선하게 만들어야 합니다. - 1% NaCl 용액 45mL에 톨루이딘 블루 원액 5mL를 첨가하여 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비합니다. 잘 섞고 pH가 약 2.3이 되도록 합니다.
알림: pH가 2.5보다 높으면 변색이 적고 염색이 가능합니다. 염색을 수행할 때마다 이 용액을 신선하게 만드십시오. - 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 양전하를 띤 슬라이드에 장착된 4-5μm 섹션을 탈파라핀화합니다. 탈파라핀화된 부분을 흐르는 물에 2분 동안 씻습니다.
- 톨루이딘 블루 작업 용액에서 2-3분 동안 섹션을 염색합니다. 증류수로 2분 동안 씻습니다.
- 95% 에탄올에 10배 담가 섹션을 탈수합니다. 100% 에탄올에 10x 담그십시오. 신선한 100% 에탄올을 10번 더 담그십시오.
- 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매에서 2분 동안 배양합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매의 두 번째 배치에서 2분 동안 배양합니다.
- 슬라이드가 d-리모넨 기반 용매로 젖어 있는 동안 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
알림: 수성 장착 매체 를 사용하지 마십시오 . - 명시야 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 비만세포의 세포질에 짙은 보라색 과립이 존재하는지 확인합니다. 다른 세포 유형은 하늘색으로 염색됩니다.
4. MPNST를 진단하고 대체 진단을 배제하기 위한 특수 염색
- 인간 MPNST의 조직학적 양상은 매우 다양하며, 여러 종양 유형이 MPNST와 유사한 양상을 보인다28. MPNST는 Schwann 세포 계통에서 유래하기 때문에 종양이 말초 신경에서 발생하는지 아니면 기존 양성 PN 내에서 발생하는지 H&E 염색 절편의 전체 검사 또는 명시야 현미경 검사를 통해 결정합니다. MPNST는 때때로 말초 신경 또는 PN과 관련이 없는 것으로 발견되지만(일반적으로 절제 중 신경에서 부주의하게 분리되거나, MPNST 과증식으로 인해 기존 PN이 파괴되거나, 병변이 전이성이기 때문에), 종양이 신경 또는 PN과 관련이 없는 경우 진단 가능성이 낮으므로 종양과 신경 또는 PN의 연관성을 찾으십시오.
- 잠재적인 MPNST를 포함하는 파라핀 블록에서 4-5μm 절편을 준비하고 2.2.1단계에 설명된 대로 양전하를 띤 슬라이드에 장착합니다. 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 섹션을 분리합니다.
- 단계 3.3.1-3.3.15에 기술된 바와 같이 표 2 에 나타낸 항체 패널로 면역조직화학을 수행한다.
- 명시야 현미경으로 면역염색을 검사합니다. MPNST는 슈반니안 분화를 보여주기 때문에 S100β, nestin 및 Sox10에 대한 균일하거나 고르지 않은 면역 반응을 찾습니다. 종양이 이 세 가지 마커에 대해 양성이 아닌 경우 표 2 를 참조하여 진단을 확립하십시오.
참고: 인간과 마우스 MPNST는 발산 구분을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 일부 인간 MPNST는 국소 횡문근아세포 분화(이러한 변이체를 악성 트리톤 종양이라고 함)를 나타냅니다. 이러한 신생물은 Schwannian 마커에 대해 염색되지만 desmin, MyoD1 및 myogenin과 같은 근육 마커도 발현합니다. 이러한 후자의 표지자에 대한 면역 반응은 연구자들이 종양을 MPNST로 진단하는 것을 단념시켜서는 안 됩니다. 활막 육종 발병기전을 모델링하기 위해 SS18-SSX 융합 유전자를 조건부로 발현하는 여러 마우스 모델이 확립되었지만, 우리가 아는 한, 동등한 융합 전사체를 자발적으로 생성하는 활막 육종 모델은 알려져 있지 않습니다. 결과적으로, 우리는 GEM 종양에서 SS18-SSX 융합 전사체를 찾지 않고 대신 면역조직화학적 프로파일에 의존합니다.
5. MPNST 등급
- WHO 등급 IV MPNST의 특징인 종양 괴사가 존재하는지 여부를 확인합니다. 등급 IV MPNST의 경우 두드러진 과세포성, 활발한 유사분열 활성(10개의 고출력(40x) 필드당 ≥4개의 유사분열) 및 세포학적 이형성을 찾습니다.
- 괴사가 없는 경우 종양을 평가하여 과세포성, 활발한 유사분열 활성 및 세포학적 이형성이 있는지 여부를 확인합니다. 괴사가 없는 상태에서 이러한 특징이 모두 존재하는 경우 종양을 WHO 등급 III MPNST로 등급을 매깁니다.
- WHO 등급 II 종양은 세포성이 증가하는 것이 특징이지만 WHO 등급 III 및 IV MPNST보다 정도가 낮습니다. WHO 등급 II MPNST에서 종양 세포의 핵은 증가된 크기(신경섬유종의 종양 세포 핵 크기의 3배 이상)와 과색증을 나타냅니다. 증가된 유사분열 활동 (10의 고성능 분야 당 <4의 유사분열)는 WHO 급료 II 종양을 위한 필요조건 아닙니다 관련됩니다.
참고: 높은 등급의 종양은 일반적으로 낮은 등급에서 진행되기 때문에 낮은 등급과 높은 등급의 부위가 동일한 MPNST에 존재할 수 있습니다. 이 상황에서 종양의 등급은 존재하는 가장 높은 등급 부위에 의해 결정됩니다.
참고: 위에서 설명한 WHO 등급 시스템이 환자 결과를 예측할 수 있는지에 대해 인간 병리학자들 사이에 논란이 있으며, 이러한 병리학자 중 일부는 MPNST를 단순히 낮은 등급 또는 높은 등급으로 분류하는 것을 선호합니다. 이 체계 하에서 고급 MPNST는 두드러진 세포학적 이형성, 활발한 유사분열 활성(10개의 고출력장당 >5개의 유사분열) 및 괴사 유무에 관계없이 현저한 과세포성을 가지고 있습니다. 저등급 MPNST는 괴사가 없지만 유사분열 활성, 세포학적 이형성 및 높은 등급의 MPNST와 생물학적 전위가 알려지지 않은 비정형 신경섬유종 신생물(ANNUBP) 사이의 중간인 세포성을 보입니다. ANNUBP와 낮은 등급의 MPNST를 구별하는 것은 이러한 기관에 대한 오랜 경험이 없는 조사관에게 어려울 수 있기 때문에 위에서 설명한 시스템을 선호합니다.
6. 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포의 배양 준비
- 신선한 종양 조각 2에서 초기 통로 P 0-GGFβ3 종양 세포를 배양합니다(단계 1.5, 그림 1A). 이 시점부터 멸균 상태를 유지하십시오.
- 종양을 작은(2-4mm) 조각으로 자르고 100mm 조직 배양 접시에 10% 태아 송아지 혈청, 2μmol/L 포스콜린, 10nmol/L 뉴레굴린 1β(NRG1β)가 포함된 DMEM10(Dulbecco의 최소 필수 배지)을 다져 종양을 해리합니다.
- 플레이트가 합류할 때까지 37%CO2에서 5oC의 다진 조직 조각에서 세포가 자라도록 합니다. 3-4일마다 미디어를 교체하십시오.
- 세포 배양을 분할합니다. 100mm 접시에서 매체를 제거하고 PBS로 셀을 세척합니다. 다진 조직을 제거하고 버립니다. PBS를 제거하고 실온에서 2-5분 동안 0.25% 트립신 1mL를 추가합니다. 세포 분리를 촉진하려면 플레이트를 부드럽게 두드리고 광학 현미경을 사용하여 박리를 확인하십시오. 필요에 따라 트립신 배양을 연장합니다.
- DMEM10 2mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브와 펠릿 셀로 5분 동안 500× g 으로 옮깁니다. 배지를 제거하고 펠릿에 신선한 DMEM10 5mL를 추가합니다.
- 셀 현탁액을 DMEM10이 포함된 2-4개의 100mm 접시에 분배합니다. 5개 이상 통로 (단계 6.1.3 및 6.1.4)를 위한 세포를 분할하지 않으며 forskolin와 NRG1β 없이 DMEM에서 그(것)들을 유지하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 통로 2에서 세포를 동결하는 것을 잊지 마십시오.
7. 면역세포화학에 의한 초기 통과 MPNST 세포의 식별 확인
- 멸균 18mm #1.5 원형 유리 커버슬립을 6웰 멸균 조직 배양 접시의 웰에 넣습니다.
- 폴리-L-라이신/라미닌 용액을 커버슬립을 덮기에 충분한 부피로 웰에 넣습니다. 증발을 최소화하기 위해 플라스틱 랩으로 플레이트를 밀봉하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 멸균 PBS로 커버슬립을 3번 세탁합니다.
참고: 코팅되지 않은 커버슬립에 초기 통과 MPNST 세포를 도금하려고 시도한 결과 폴리-L-라이신/라미닌 코팅이 없는 경우 세포가 잘 부착되지 않는 것을 발견했습니다. - 성장 배지에 있는 세포 현탁액 2mL를 커버슬립이 들어 있는 각 웰에 부드럽게 추가하여 10,000개의 세포를 커버슬립에 플레이트합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 5 % CO2 로 37 ° C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
- 다음날 아침, PBS로 커버슬립을 2 x 5분 동안 헹굽니다.
- PBS에서 4% 파라포름알데히드로 세포를 실온에서 18분 동안 고정합니다.
- PBS로 커버슬립을 3 x 5분 동안 헹굽니다. 원하는 경우 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 이 시점에서 4°C에서 보관합니다.
- PBS에서 신선한 50mM NH4Cl을 만드십시오. 실온에서 10분 동안 PBS의 50mM NH4Cl에서 커버슬립을 배양하여 알데히드를 소멸시킵니다.
- PBS의 0.3% Triton X-100에서 실온에서 15분 동안 커버슬립을 배양하여 세포를 투과시킵니다. PBS로 커버슬립을 3 x 5분 동안 세탁합니다.
- 차단 완충액(1% 소 혈청 알부민, 0.2% 무지방 분유 및 0.3% Triton X-100을 함유한 PBS 1개)에 커버슬립을 실온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
- 차단 완충액을 제거하고, 모종양에 존재하는 MPNST 마커(전형적으로 S100β, Nestin, Sox10)를 인식하는 1차 항체를 차단 완충액에 미리 결정된 최적 희석액으로 희석하여 첨가한다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 싸서 가습 챔버에서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
- PBS로 3 x 5분 동안 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다. 차단 완충액에 희석한 형광 표지된 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- PBS로 3 x 5 분 동안 씻으십시오. 커버슬립을 1-5 μg의 Hoechst 염료에 10분 동안 배양합니다. 빛 으로부터 계속 보호하십시오.
- PBS로 커버슬립을 5분 동안 세탁합니다. 1:1 1x PBS/글리세롤을 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 형광 현미경을 사용한 이미지.
- 폴리-L-라이신/라미닌 용액을 커버슬립을 덮기에 충분한 부피로 웰에 넣습니다. 증발을 최소화하기 위해 플라스틱 랩으로 플레이트를 밀봉하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 멸균 PBS로 커버슬립을 3번 세탁합니다.
8. 종양원성을 입증하기 위한 초기 통로 종양 세포의 동종이식
- DMEM10에서 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포를 80% 밀도로 성장시킵니다. 실온의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 세포를 한 번 헹굽니다. 세포를 비효소 세포 해리 용액으로 30초에서 1분 동안 처리하여 기질에서 제거합니다. 비효소 세포 해리 시약 1mL당 DMEM10 5mL를 추가합니다.
알림: 셀룰러 해리는 최대 10-20분까지 훨씬 더 오래 걸릴 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.
참고: 이식 효과가 감소하므로 세포를 합류하도록 성장시키지 마십시오.- 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 세포를 5분 동안 5 × g 으로 스핀 다운시키고 DMEM10 100 μL당 106 세포× 1-2 농도로 재현탁시킵니다. 주입할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 이소플루란 기화기의 유도 챔버에서 NOD-SCIDγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) 마우스를 마취합니다. 동물을 엎드려 눕히고 70% 에탄올로 주사 부위를 소독합니다. 주입하기 전에 해당 부위를 공기 중에서 건조시키십시오. 주입하기 전에 세포가 실온에 오도록 하십시오.
- 오른쪽 측면에 1-2 x 106 세포를 피하 주사합니다. 침구가 없는 케이지에 마우스를 혼자 넣고 회복할 수 있도록 합니다. 저체온증을 방지하기 위해 케이지의 일부만 가열 패드 위에 있는지 확인하십시오. 이것은 마우스가 과열될 경우 이동할 수 있는 영역을 제공합니다.
참고: 일부 이식편은 취하지 않을 수 있으므로 각 초기 통로 배양에 최소 3마리의 마우스를 접목합니다. - 이식편이 15-60일 동안 자라도록 두십시오. 매주 3회 동물 건강을 평가하고 각 검사에서 체중 및 행동 변화를 포함한 신체 상태 점수를 기록합니다. 최대 허용 이식편 크기에 도달한 쥐를 제거하거나 이산화탄소 안락사 후 자궁경부 탈구를 사용하여 생쥐를 제거한다. 사망 시 나이를 며칠 단위로 기록합니다. 종양이 외부에서 보이면 종양 치수(길이, 너비 및 높이)를 기록합니다.
참고: 경험에 비추어 볼 때, 다양한 초기 통과 MPNST 배양은 다양한 효율성으로 접목하고 접목 성장에 필요한 시간도 다릅니다. 동물은 IACUC가 승인한 최대 허용 종양 크기 및/또는 인도적 종점을 초과하여 진행해서는 안 됩니다.
- 종양을 채취하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀에 포함하고, 섹션 2.1-2.2.9에 설명된 대로 H&E 염색을 수행하여 동종 이식편이 반응성 조직이 아닌 종양인지 확인합니다. 필요한 경우 모종양에 존재했던 마커에 대한 이식편을 면역염색합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 2는 P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 매우 명백한 신생물의 예를 보여줍니다. 육안으로 쉽게 식별할 수 있는 종양은 그림 2A(화살표)와 같이 신체 부위를 팽창시키는 종괴로 보일 수 있습니다. 신생물이 잠재적으로 말초 신경초 종양인지 여부를 결정할 때 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우 MRI 스캔(그림 2B)은 종양이 좌골 신경(화살촉)과 관련이 있음을 보여줍니다. 이 연관성은 쥐를 안락사시키고 종양을 해부한 후에 확인되었다. 크기가 크다고 해서 반드시 종양이 악성이라는 것을 나타내는 것은 아닙니다. 이 경우, 종양에 대한 조직학적 검사(그림 2C)는 종양이 신경섬유종이라는 것을 보여주었습니다. 그러나 가장 흔하게는 쥐의 부검을 수행하기 전까지는 심하게 명백한 종양이 확인되지 않습니다. 그림 2D는 이 동물의 상완신경총(brachial plexus) 내에서 발생한 크고 살이 많은 MPNST를 보여줍니다.
도 3은 프로토콜 섹션 1에 설명된 절차에 따라 제조된 P 0-GGFβ3 마우스의 MPNST 및 신경섬유종의 대표적인 예를 보여줍니다. 그림 3A-J는 P0-GGFβ3 마우스 콜로니에서 독립적으로 발생하는 MPNST의 10가지 예를 보여줍니다. MPNST의 조직학적 모양은 동일한 동물에서 독립적으로 발생하는 MPNST 사이에서도 매우 다양할 수 있습니다. 이러한 조직학적 가변성은 면역조직화학적 염색이 있는 P 0-GGFβ3 MPNST의 진단을 일상적으로 확인하는 이유를 보여줍니다. 또한 일부 근친 마우스 균주에서 명백히 관련이 없는 다른 종양 유형이 낮은 빈도로 산발적으로 발생한다는 점을 지적하고(예: C57BL/6J 배경에서 전이유전자를 운반하는 P 0-GGFβ3 마우스에서 림프종을 여러 번 발견함), 종양 진단을 확인하기 위해 면역조직화학을 사용하는 것의 중요성을 더욱 강조합니다. 조직학적 외관의 다양성에도 불구하고, 그림 3A-J에 예시된 10개의 종양은 모두 S100β 및 네스틴에 대해 면역반응성이었고 다른 종양 유형의 마커에 대해서는 음성이었습니다. 그림 3K는 적절하게 석회질이 제거된 척추 및 관련 조직의 대표 이미지를 보여줍니다. 척수, 신경근, 척추체 및 골격근은 모두 서로 적절한 해부학적 관계를 유지합니다. 그림 3L은 척추체와 그 위에 놓인 척수의 고출력 이미지입니다. 이 조직은 적절하게 석회질을 제거했기 때문에 뼈가 잘리거나 접히지 않고 쉽게 절단되었으며 골수 공간에서 골수를 쉽게 식별할 수 있습니다. 조직이 제대로 석회질을 제거하지 않았다면 마이크로톰 칼날에 걸려 단면이 찢어져 인접 조직(척수, 척수근 및 골격근)에 심각한 손상을 입혔을 것입니다. 그림 3M은 P 0-GGFβ3 마우스의 등쪽 신경근 내에서 발생하는 신경섬유종의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 이 종양은 그림 3A-J에 표시된 MPNST보다 세포성이 적습니다. 신경섬유종의 주요 진단은 신경섬유종이 종양성 슈반(neoplastic) 슈반(Schwann) 세포와 비종양성 비만세포(non-neoplastic mast cell), 대식세포(macrophage), 섬유아세포(fibroblast) 및 신경에 침투하여 축삭돌기를 분산시키는 회음부 유사 요소의 복잡한 혼합물로 구성되어 있다는 것입니다.
그림 4는 망상신경섬유종의 초기 식별과 망상신경섬유종과 MPNST를 구별하는 데 가장 유용한 염색의 예를 보여줍니다. 그림 4A는 P 0-GGFβ3 망상형 신경섬유종에서 S100β 면역 활성을 보여줍니다. S100β 면역반응은 세포의 하위 집단에서만 뚜렷하게 나타나며, 이는 신경섬유종이 종양성 슈반(Schwann) 세포와 기타 비종양 요소(섬유아세포, 비만세포, 대식세포, 회음부 유사 세포, 잘 정의되지 않은 CD34 면역반응성 세포 집단 및 혈관)의 혼합물로 구성되어 있다는 사실과 일치합니다. 안타깝게도, S100β 염색은 MPNST에서 고르지 않을 수 있기 때문에 S100β 염색은 망상형 신경섬유종과 MPNST를 구별하지 못합니다(H&E 염색은 이러한 목적에 유용하지만, MPNST는 일반적으로 망상형 신경섬유종보다 세포성이 더 높기 때문입니다[그림 3 참조]). 종양성 슈반(Neoplastic Schwann) 세포는 그림 4B에 제시된 P 0-GGFβ3 MPNST에서 입증된 바와 같이 중간 필라멘트 네스틴에 대해서도 면역 반응성이 있습니다. 또한 종양성 슈반(Neoplastic Schwann) 세포는 그림 4C의 MPNST에서 볼 수 있듯이 전사 인자 Sox10에 대한 핵 면역 반응을 나타내는 경우가 많습니다. 망상형 신경섬유종과 MPNST를 구별하는 데 유용한 특징은 비만세포의 존재와 Ki67 증식 마커에 대한 두드러진 면역반응입니다. 그림 4D는 세포질 과립의 두드러진 변색성 보라색 염색으로 쉽게 식별할 수 있는 비만세포의 존재를 강조하기 위해 P 0-GGFβ3 망상형 신경섬유종에서 수행된 Unna 염색을 보여줍니다. 비만 세포는 MPNST에 존재하지 않습니다. 대조적으로, Ki67 면역 반응은 그림 4E에 표시된 P 0-GGFβ3 종양에서 볼 수 있듯이 망상형 신경섬유종에서 거의 존재하지 않습니다. 핵 Ki67 표지는 일반적으로 P 0-GGFβ3 마우스의 삼차 신경절에서 발생하는 현미경 MPNST에서 볼 수 있듯이 종양 세포의 매우 높은 비율에 존재합니다(그림 4F).
그림 5 는 새로 개발된 GEM 모델에서 신경섬유종의 세포 조성을 완전히 특성화하기 위해 수행하는 염색의 예를 보여줍니다. 이 그림에 표시된 염색은 인간 피부 신경 섬유종에서 얻은 것이지만 GEM 종양에서 본 것과 모양이 동일합니다. CD117(c-Kit)에 대한 면역반응은 신경섬유종 내 비만세포에 존재하므로 Unna 염색에서 볼 수 있는 것과 매우 유사한 분포를 보입니다(그림 3A 참조). 대식세포는 또한 pan-macrophage marker Iba1에서 볼 수 있듯이 신경섬유종 전체에 흩어져 존재합니다( 그림 5D 참조). 여기에는 CD163 및 CD86에 대해 면역 반응성이 있는 대식세포의 하위 분류가 포함됩니다(각각 그림 5B 및 그림 5C 참조). 신경섬유종에 있는 슈바니안 원소의 일부도 Sox10에 대한 핵 면역 활성을 보여줍니다. 섬유아세포는 TCF4에 대한 면역 반응으로 강조할 수 있습니다. 그림 5G에서 CD31은 신경섬유종 내의 혈관 요소를 표지하는 반면, 그림 5H에서 입증된 CD34는 상주 조직 대식세포(30 )의 하위 집단 또는 Schwann 세포도 섬유아세포(31)도 아닌 신경초(nerve sheath) 세포의 새로운 집단으로 제안된 세포의 수수께끼 같은 수지상 집단을 표지합니다.
그림 6은 인간 망상형 신경섬유종과 MPNST를 P 0-GGFβ3 마우스에서 볼 수 있는 종양과 비교하고 MPNST와 혼동될 수 있는 일부 인간 종양 유형의 대표적인 예를 제공하기 위해 포함되었습니다. 그림 6A는 NF1 환자의 상완신경총에서 발생한 망상신경섬유종을 보여줍니다. 그림 6B는 동일한 망상형 신경섬유종에서 발생한 WHO 등급 IV MPNST를 나타냅니다. 그림 6B는 현저한 과세포성 및 세포 이형성, 활발한 유사분열 활성 및 종양 괴사를 포함하여 WHO 등급 IV MPNST의 몇 가지 특징을 보여줍니다. 비교를 위해, 그림 6C는 상당한 세포 이형성이 있지만 IV 등급 MPNST보다 덜 과세포적이며, 유사분열이 존재하더라도 더 적은 유사분열 활성을 보여주는 WHO 등급 II MPNST를 보여줍니다. 그림 6D는 종양 세포의 외피가 얽혀 있는 특징적인 "헤링본" 패턴이 있는 섬유육종을 보여줍니다. 그러나 일부 MPNST는 유사한 패턴을 갖기 때문에 이 패턴이 반드시 섬유육종과 MPNST를 구별하는 것은 아닙니다. 또한, 그림 6E에 제시된 고출력 보기는 그림 6B에 제시된 WHO 등급 IV MPNST에서 볼 수 있는 것과 유사한 세포 형태를 보여줍니다. 그림 6F는 평활근육종을 보여줍니다. 대부분의 MPNST와 달리 평활근육종은 평활근 액틴(actin) 및 데스민(desmin)과 같은 근육 마커에 대해 면역 반응성이 있습니다. 평활근 액틴 면역 반응은 종양마다 다를 수 있으며, 일부 종양은 강렬하고 균일한 면역 활성을 나타내고(그림 6G) 다른 종양은 종양 내 세포 가변성을 나타내는 면역 활성을 보입니다(그림 6H). Desmin 면역 반응은 평활근육종에서도 고르지 않을 수 있습니다(그림 6I). 흑색종은 형태가 매우 다양하며, 일부 종양은 다각형 세포로 구성되고(그림 6J) 다른 종양은 MPNST 세포의 형태를 모방할 수 있는 방추 세포로 구성됩니다. 흑색종은 MART1과 같은 멜라노솜 마커에 대한 면역 반응으로 MPNST와 구별할 수 있습니다(그림 6K). 그러나 MPNST와 같은 흑색종은 S100β 및 Sox10에 대해 양성인 경우가 많습니다(그림 6L).
그림 7은 P0-GGFβ3 마우스에서 분리한 WHO 등급 II, III 및 IV MPNST의 병리학적 특징을 보여줍니다. 그림 8은 저전력(그림 7A) 및 고전력(그림 7B)에서 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 셀의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 이러한 세포의 종양원성은 연질 한천에 현탁할 때 콜로니를 형성하고(그림 7C) 면역 결핍 마우스에서 피하 동종이식될 때 이식편을 형성하는 능력(그림 7D)에 의해 입증됩니다.
그림 1: P 0-GGFβ3 마우스의 종양 및 기타 조직을 처리하는 데 사용되는 워크플로우. (A) 눈에 잘 띄는 종양을 채취하여 1) 4% 파라포름알데히드에 고정한 후 면역조직화학 및 조직화학을 수행하고, 2) 조기 통과 종양 세포 배양 및/또는 게놈 분석을 확립하고, 3) 단백질, DNA 또는 RNA 분리를 위해 액체 질소를 사용하여 급속 냉동합니다. (B) 종양을 절제한 후 쥐의 몸체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 내부 장기를 제거합니다. 이러한 장기는 신생물 및 기타 병리학적 과정의 현미경적 증거를 식별하기 위해 수행되는 조직학적 검사를 위해 샘플링됩니다. (C) 내부 장기를 제거한 후 사지(머리, 팔다리, 꼬리)와 피부를 사체에서 제거합니다. 척추, 인접 갈비뼈 및 인접 골격근은 0.3M EDTA/4% 파라포름알데히드(pH 8.0)를 사용하여 석회질을 제거합니다. 그런 다음 석회질을 제거한 조직을 파라핀으로 포매하고 면역조직화학적 및 조직화학적 검사를 위해 조직의 절편을 준비합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: P 0-GGFβ3 마우스에서 매우 명백한 신경섬유종 및 MPNST의 대표 이미지. (A) 오른쪽 옆구리에 크고 뚜렷한 종양이 있는 P0-GGFβ3 마우스(화살표). (B) 이 쥐의 MRI 스캔은 종양이 좌골 신경(화살촉)에 연결되어 있고 피하(화살표, 벌크 종양 덩어리) 내에서 확장하기 위해 위에 있는 근막을 통해 성장했음을 보여줍니다. (ᄃ) 이 종양을 현미경으로 검사해 본 결과, 종양의 크기가 크기는 하지만 종양이 신경 섬유종임을 알 수 있다. (D) P 0-GGFβ3 마우스의 상완신경총에서 발생한 큰 다육질 MPNST. 눈금 막대 = 100 μm. (C). 약어: MPNSTs = 악성 말초 신경초 종양; MRI = 자기 공명 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 프로토콜 섹션 1에 설명된 대로 준비된 MPNST, 석회질 제거 척추 및 신경섬유종의 대표 이미지. (A-J) 절제 및 H&E 염색 P 0-GGFβ3 MPNST는 조직학적 변동성을 나타냅니다. 모든 이미지는 독립적으로 발생하는 MPNST입니다. 이러한 조직학적 다양성에도 불구하고, 이들 종양은 모두 표 1에 표시된 MPNST 마커에 대한 적절한 표지를 보였다. 스케일 바 = 200 μm. (K) 석회질이 제거된 척추의 H&E 염색 단면의 대표 이미지. 이 이미지에서 다음과 같은 구조를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 척수; 척추뼈; 등쪽 척추 신경 뿌리의 등쪽 뿌리 신경절; 그리고 척추 주위 골격근. 배율 4x. (L) K에 표시된 척수와 척추의 고배율 이미지는 이 방법론을 사용한 석회질 제거 후 뼈의 적절한 모양을 보여줍니다. 배율 10x. (M) P 0-GGFβ3 마우스의 등쪽 신경근 신경섬유종의 대표 이미지. 배율 40x. 스케일 바 = 100 μm. 약어: MPNSTs = 악성 말초 신경초 종양; H&E = 헤마톡실린 및 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 망상형 신경섬유종의 초기 식별 및 MPNST와의 구별에 사용된 진단 염색. (A) P 0-GGFβ3 망상형 신경섬유종에서 S100β에 대한 면역염색. 이 항원에 대한 강렬한 갈색 염색은 이 종양의 일부 세포에만 존재하며, 이는 신경섬유종이 종양성 슈반(Schwann) 세포와 여러 다른 비종양성 세포 유형으로 구성되어 있다는 사실과 일치합니다. (B) 중간 필라멘트 네스틴(빨간색)에 대해 염색되고 비스벤지미드(파란색, 핵 염색)로 대조 염색된 P 0-GGFβ3 MPNST의 면역형광 이미지. (C) 전사 인자 Sox10에 대해 염색된 MPNST. 강렬한 면역 반응성(갈색)은 종양 세포 하위 집합의 핵에서 분명합니다. (D) Unna 염색 후 P 0-GGFβ3 망상형 신경섬유종의 고출력 보기. 이 염색은 비만 세포에서 과립의 변색(보라색) 염색을 생성합니다. 망상신경섬유종은 비만세포가 없기 때문에 MPNST와 구별할 수 있습니다. (이,에프) (E) a P 0-GGFβ3 망상형 신경섬유종 및 (F) A P0-GGFβ3 MPNST에서 Ki67 면역조직화학. 두 절편 모두 헤마톡실린(청색 핵 염색)으로 대조염색되었으며, Ki67 면역 반응은 이러한 면역과산화효소 염색에서 갈색 핵 염색으로 분명합니다. 망상형 신경섬유종에서는 갈색 핵 염색이 뚜렷하지 않은 반면, 대부분의 종양 세포핵은 MPNST에서 양성입니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: MPNST = 악성 말초 신경초 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 신경섬유종을 구성하는 세포의 하위 집단을 식별하는 데 사용된 면역염색제의 대표 이미지. 인간 피부 신경섬유종에서 얻은 이러한 면역형광 이미지는 (A) CD117(c-Kit, 비만세포의 마커), (B) CD163(M2 대식세포), (C) CD86(M1 대식세포), (D) Iba1(범 대식세포 마커), (E) Sox10(슈반 세포 마커), (F) TCF4(섬유아세포 마커), (G) CD31(혈관 마커) 및 (H)에 대해 염색되었습니다) CD34 (신경 섬유종에서 뚜렷하고 잘 이해되지 않은 세포 하위 집단을 표시합니다). 배율 60x, 축척 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 망상신경섬유종, MPNST 및 MPNST의 감별 진단에서 고려되는 기타 인간 종양 유형의 대표 이미지. (A) NF1 환자의 상완신경총에서 발생하는 망상신경섬유종으로, 이 신생물의 전반적인 하부 세포성과 양성 외관을 보여줍니다. H&E 염색 절편에서는 쉽게 시각화되지 않지만, 세포 유형의 복잡한 혼합물이 존재합니다. 유사분열은 보이지 않습니다. 배율 : 40x. (B) A에 설명 된 망상 신경 섬유종에서 발생한 WHO 등급 IV MPNST. 훨씬 더 높은 수준의 세포성에 주목하십시오. 화살표는 유사분열 수치를 나타내고 별표는 이 미세한 필드의 오른쪽 상단 부분에 있는 종양 괴사 영역을 나타냅니다. 배율 : 40x. (C) WHO 등급 II MPNST. 이 종양은 B에 예시된 WHO 등급 IV MPNST보다 세포성 정도가 낮습니다. 그러나 A에 설명된 망상형 신경섬유종에서 명백한 것보다 더 많은 핵 이형성증과 과색증이 있습니다. 화살표는 이 신생물에서 우연히 만난 간헐적인 유사분열 형상 중 하나를 나타냅니다. 배율: 63x. (D) 이 종양 유형에서 일반적으로 볼 수 있는 "헤링본" 패턴(종양 세포의 얽힌 외피)을 보여주는 성인형 섬유육종의 저배율 보기. 불행히도, 헤링본 구조는 일부 인간 MPNST에서도 발생하므로 섬유육종과 MPNST를 구별하는 데 사용할 수 없습니다. 배율 : 20x. (E) D에 설명 된 섬유 육종의 더 높은 검정력 보기. 이 섬유육종의 세포 형태와 B에 표시된 WHO 등급 IV MPNST에서 명백한 세포 형태 사이의 유사성에 주목하십시오. 배율: 40배. (F) MPNST에서 볼 수 있는 변이 범위에 속하는 세포 형태를 보여주는 평활근육종의 고출력 이미지. 배율: 40배. (G) F에 설명된 평활근육종의 평활근 액틴에 대한 면역염색. 종양 세포는 이 항원에 대해 균일하고 강렬한 면역 반응을 보입니다. 배율 : 40x. (H) 다른 평활근 육종에서 평활근 액틴에 대한 면역 염색. 이 종양에서는 면역 반응 정도에 더 큰 변동성이 있으며 일부 세포는 다른 세포보다 더 강렬하게 염색됩니다. 동일한 항원에 대한 면역반응이 하나의 종양에 균일하게 존재하고 다른 신생물의 종양 세포의 하위 집합에만 존재하는 것은 드문 일이 아닙니다. 배율 : 40x. (I) 제 3 평활근 육종의 desmin에 대한 면역 염색. 이 종양에서는 종양 세포의 하위 집합만이 이 항원에 대해 강렬한 면역 반응을 보입니다. (J) 전이성 흑색종. 흑색종은 직육면체에서 방추형에 이르기까지 매우 다양한 형태를 갖는 것으로 유명합니다. 후자의 형태를 가진 종양은 특히 흑색종과 MPNST가 모두 S100β 및 Sox10 면역 반응을 나타낼 수 있다는 점을 감안할 때 MPNST와 혼동될 가능성이 가장 높습니다. 배율: 40배. (K) J에 예시된 종양의 흑색종 마커 MART1에 대한 면역 반응. 배율 : 40x. (L) J에 표시된 흑색종에서 전사 인자 Sox10에 대한 핵 면역 반응. 배율: 40x, 스케일 바 = 100μm. 약어: MPNST = 악성 말초 신경초 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: WHO 등급 II-IV P 0-GGFβ3 MPNST의 대표 이미지. (A) WHO 등급 II MPNST의 저출력 및 (B) 고출력 현미경 사진. 세포도는 패널 C에 표시된 WHO 등급 III MPNST보다 낮고 D에 있는 종양 세포의 핵은 패널 B에서 볼 수 있는 것보다 더 과색(더 어둡다)입니다. (C) WHO 등급 III MPNST의 저출력 및 (D) 고출력 현미경 사진. 이 종양은 10개의 고출력 필드 당 >4개의 유사분열 수치를 보여주었으며, 세포는 더 조밀하게 포장되어 있고 더 과색성, 비정형 핵을 가지고 있었습니다. (E) WHO 등급 IV MPNST의 저전력 및 (F) 고전력 보기. 패널 F의 하단 중앙 부분에 있는 괴사의 초점에 주목하십시오. 저전력 = 20x. 고출력 = 40x, 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 연질 한천의 성장과 동종이식편으로서의 성장 능력에 의해 입증된 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포와 그 종양원성의 대표 이미지. (A) 초기 통과 P0-GGFβ3 MPNST 세포의 저출력 및 (B) 고출력 위상차 이미지. (C) 연질 한천에서 성장하고 수단 블랙으로 염색된 P 0-GGFβ3 MPNST 세포; 식민지는 한천에서 검은 반점으로 분명합니다. (D) 프로토콜에 기술된 바와 같이 면역결핍 마우스에서 P 0-GGFβ3 MPNST 세포 후에 형성된 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지를 피하 이식하였다. (E) Celigo Image Cytometer에 의해 결정된 5일 동안 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포의 증식. 저전력 = 10x, 고전력 = 40x; 축척 막대 = 모든 패널에 대해 100μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 사용법 | 종 반응성/등급 |
| CD117 시리즈 | 미리 희석된 | 토끼 단클론 |
| CD163 시리즈 | 1:200 | 마우스 monoclonl |
| CD31 시리즈 | 1:50 | 토끼 polyclonal |
| CD34 시리즈 | 1:2000 | 토끼 단클론 |
| CD86 시리즈 | 1:1000 | 토끼 단클론 |
| 사이토케라틴 | 1μg/mL | 마우스 단클론 |
| 데스민 | 1:50 | 마우스 단클론 |
| 이바1 | 1:500 | 다클론 토끼 |
| 기-67 | 1:50 | 토끼 단클론 |
| 마트1 | 1μg/mL | 마우스 단클론 |
| 네스틴 | 1:1,000 | 마우스 단클론 |
| 증권 시세 표시기 | 1:100 | Rabbot 단클론 |
| 시즌 100B | 1:200 | 토끼 polyclonal |
| 단순 관계 | 1:100 | 마우스 단클론 |
| 삭스10 | 1:10 | 마우스 단클론 |
| TCF4/TCFL2 시리즈 | 1:100 | 토끼 단클론 |
표 1: 망상신경섬유종 및 악성 말초신경초종양의 진단에 사용되는 항체. GEM 망상형 신경섬유종(S100β, Sox10, CD117, Ki67)의 일상적인 식별, MPNST 진단 및 신경섬유종에 존재하는 다른 세포 유형의 완전한 평가에 사용되는 항체. 약어: MPNST = 악성 말초 신경초 종양.
| S100β | 네스틴 | 삭스10 | 마트1 | 증권 시세 표시기 | 데스민 | 평활근 액틴 | 사이토케라틴 | SS18-SSX 퓨전 | ||
| 엠피엔스트(MPNST) | 50-90%, 일반적으로 초점 | 긍정적1 | ~30% | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | |
| 섬유육종 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | |
| 평활근육종 | 드문 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 50-100% | 플러스 | ~40% | 마이너스 | |
| 상피육종 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 플러스 | 마이너스 | |
| 흑색종 | 플러스 | 플러스 | 85% | 플러스 | 플러스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | |
| 단일성 활막 육종 | ~30% | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 마이너스 | 플러스 | 플러스 | |
표 2: 인간의 종양 정체성을 확립하는 데 사용되는 마커. 이러한 면역조직화학적 및 조직화학적 마커는 종양 현미경 형태 평가와 함께 MPNST를 이를 모방하는 다른 신생물과 구별하는 데 사용됩니다. 인간 MPNST에 대해 일반적으로 고려되는 감별 진단에는 성인형 섬유육종, 상피육종, 평활근육종, 단상 활막 육종 및 흑색종이 포함됩니다. 성인형 섬유육종은 현미경으로 헤링본 무늬를 가지고 있으며 비멘틴에 대한 염색이 있지만 S100β는 그렇지 않습니다. 평활근육종(MPNST는 아님)은 데스민에 대해 면역 반응성이 있습니다. 평활근육종은 또한 끝이 뭉툭한 형태를 가진 핵을 가지고 있습니다. 상피 육종(MPNST는 아님)은 사이토케라틴에 대해 면역 반응성이 있습니다. 흑색종은 MPNST와 마찬가지로 S100β 양성일 수 있지만 MART-1 및 PMEL에 대해서도 면역 반응성이 있습니다. 약어: MPNST = 악성 말초 신경초 종양. 1개S100β와 nestin의 조합은 MPNST를 매우 잘 예측합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시된 조직학적 및 생화학적 방법은 신경섬유종 및 MPNST 발병기전의 GEM 모델을 진단하고 특성화하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 수년에 걸쳐, 우리는 이러한 방법론이 GEM 모델 21,25,26에서 발생하는 말초 신경초 종양의 병리학을 평가하는 데 매우 유용하다는 것을 발견했다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 GEM 모델의 종양이 인간 종양의 병리를 얼마나 정확하게 재현하는지 결정하는 데 유용하지만 이러한 전략에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우선, P 0-GGFβ3 마우스는 종양 표현형의 거의 완전한 침투를 보여주며, 이는 게놈 연구 및 게놈 스케일 shRNA 스크리닝에 사용할 수 있는 신경섬유종 및 MPNST 21,25,26을 가진 많은 수의 마우스를 비교적 쉽게 얻을 수 있도록 합니다. 이 모델에서 표현형의 높은 침투율은 또한 P 0-GGFβ3 마우스를 전임상 시험에 매우 유용하게 만듭니다. 그러나 이것이 모든 GEM 암 모델에 해당되는 것은 아니라는 점을 인식해야 한다. 이것이 우리가 종양 발병을 예측할 수 있는 동물의 비율을 결정하는 것의 중요성을 강조한 이유입니다. 흔하게 종양이 발생하지 않는 동물 모델로 작업할 때 자기 공명 영상 또는 양전자 방출 단층 촬영과 같은 영상 양식을 사용하여 전임상 시험 또는 기타 연구에 들어갈 수 있는 종양을 보유한 동물을 확실히 식별하는 것이 유리하다는 것을 알게 되었습니다. 그러나 이 방법은 반복적인 스캔이 필요한 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 이것이 우리가 관심 GEM 모델26의 평균 생존 시간을 확립하는 것의 중요성을 강조한 이유이며, 동물이 종양이 발생할 것으로 예상되는 시점을 이해하면 원하는 표현형을 가진 동물을 식별하는 데 필요한 스캔 횟수 및 관련 비용을 줄일 수 있습니다.
쥐의 큰 종양은 여전히 실제로는 다소 적은 양의 조직이라는 것을 인식하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜에서는 종양 조직을 3등분하고 조직학/면역조직화학, 조기 통과 세포 배양 확립 및 관심 생체 분자(단백질, RNA, DNA)의 분리에 전념하는 프로세스를 권장합니다. 그러나 종양의 크기는 다양하며 종양이 매우 작으면 이러한 방식으로 분열할 수 있는 충분한 조직을 갖지 못할 수 있습니다. 이 경우, 연구자는 종양 진단 또는 종양 조직의 다른 사용이 우선시되는지 여부를 결정해야 한다32. 이러한 상황에서 우리의 편견은 다른 실험을 시작하기 전에 우리가 무엇을 하고 있는지 이해하기 위해 적절한 진단을 받아야 한다는 것입니다. 우리는 종양 진단이 일반적으로 신생물의 1/3 미만을 사용하여 쉽게 확립될 수 있다는 것을 발견했습니다. 작은 종양을 다룰 때는 일반적으로 종양 조직의 작은 조각을 제거하고 조직학 조직으로 싸서 조직 카세트에 넣어 처리 중에 조직이 손실되지 않도록 합니다. 이 접근법의 단점은 WHO 등급이 필요한 경우 연구자가 신생물을 과소 등급화할 수 있다는 것입니다. 이는 암에서 일반적으로 낮은 등급과 높은 등급의 영역이 공존하기 때문이며, 매우 작은 샘플을 채취한 경우 얻은 등급은 종양 샘플을 채취한 위치에 따라 달라집니다.
말초 신경초 종양 식별을 확립하기 위해 설명하는 프로토콜은 면역조직화학에 크게 의존합니다. 일부 세포 유형(예: 비만 세포를 식별하기 위해 Unna 염색 수행)에 사용할 수 있는 간혹 대체 접근법이 있지만, 신경섬유종 및 MPNST에 존재하는 대부분의 세포 유형에는 균일하지 않습니다. 결과적으로, 사용될 면역조직화학적 절차가 적절하게 최적화되었는지 확인하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 몇 가지 문제가 진단 면역조직화학을 손상시킬 수 있습니다. 연구자가 이전에 사용하지 않은 1차 항체로 희석 시리즈를 수행하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 희석 계열은 이전에 최적화된 항체의 새로운 배치를 사용할 때 수행되어야 한다33. 또한 신선한 시약 배치를 사용할 수 있도록 주의를 기울여야 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 과산화수소와 DAB는 특히 제대로 작동하지 않는 경향이 있으며, 이로 인해 조사관이 얼룩이 음성이라고 부적절하게 결정할 수 있습니다.
망상신경섬유종, MPNST 및 MPNST의 감별 진단에서 고려되는 다양한 유형의 신생물에 대해 설명하는 면역조직화학적 프로파일은 우리가 가장 일반적으로 접하는 것입니다 21,25,26,34. 그러나 MPNST 및 이러한 다른 악성 종양에서 발산 분화가 드문 일이 아니기 때문에 연구자는 여기에서 설명하는 것과 다소 다른 염색 프로파일을 접할 수 있습니다. 이러한 뉘앙스로 인해 종양 형성의 새로운 GEM 모델을 특성화하는 팀에 경험이 풍부한 인간 또는 수의학 병리학자를 포함할 것을 강력히 권장합니다. 이 프로토콜에서는 GEM 및 인간 MPNST에 WHO 등급을 적용했습니다. 등급 기준이 비교적 잘 정의되어 있고 인간과 마우스 MPNST를 비교하기 쉽기 때문에 이 등급 시스템을 선호합니다 2,28. 그러나 우리는 WHO 등급 기준이 병리학자들에 의해 균일하게 받아들여지지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 이는 MPNST에 적용되는 세 가지 WHO 등급이 환자의 임상 결과를 예측하는지 명확하지 않기 때문입니다. 이 때문에 많은 병리학자들은 MPNST를 단순히 저등급 또는 고등급 악성 종양으로 분류하는 것을 선호합니다. 이 접근법을 사용하면 MPNST의 약 85%가 활발한 유사분열 활성, 현저한 세포 이형성 및 종양 괴사를 동반할 수 있는 과색증을 특징으로 하는 고급 악성 종양으로 간주됩니다. 낮은 등급의 MPNST는 세포성, 과색증 및 유사분열 활성이 적습니다.
우리는 조기 통과 MPNST 세포의 동종이식이 이러한 배양의 종양원성을 검증하는 간단한 방법이라는 것을 발견했습니다. 그러나, 세포가 동종이식편(32)을 확립하지 않을 때 몇 가지 문제가 고려되어야 한다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 초기 통로 MPNST 세포의 압도적 다수가 동종이식편을 확립하지만, 때때로 그렇지 않은 초기 통로 배양을 접하게 됩니다. 이러한 실패에도 불구하고, 어레이 비교 게놈 하이브리드화(aCGH) 및 전체 엑솜 시퀀싱은 이러한 초기 통로 배양이 종양 세포인 것과 일치하는 여러 게놈 이상을 가지고 있음을 보여주었습니다25,26. 우리는 또한 건강하지 않은 초기 통로 배양을 발견했는데, 일반적으로 접목을 위해 배양물을 수확하기 전에 배양물이 합류하도록 허용되었기 때문입니다. 거친 취급으로 손상된 세포(예: 비효소적 세포 해리 용액을 위아래로 과도하게 여러 번 피펫으로 과도하게 오래 배양한 경우)도 이식 시 성능이 저하됩니다. 또한 이식편 설립을 위해 표시한 시간은 우리의 경험을 바탕으로 한 추정치입니다. 때때로, 우리는 동종이식을 성공적으로 확립할 수 있지만 그렇게 하는 데 더 오랜 시간이 걸리는 초기 통로 배양을 접했습니다.
위에서 설명한 접근법은 새로 개발된 말초 신경계 종양의 GEM 모델의 주요 측면을 특성화하고 이러한 동물이 발병하는 신경섬유종 및 MPNST를 적절하게 진단하는 포괄적인 수단을 제공합니다. 조기 통과 MPNST 배양을 확립하고 이러한 배양을 동종 이식에 사용하기 위해 간략하게 설명하는 방법은 GEM 모델에서 확인된 신생물의 종양원성에 대한 명확한 증거를 제공합니다. 우리는 초기 통로 배양을 확립할 때 개별 클론의 선택을 수행하지 않는다는 것을 강조할 것입니다. 종양 세포를 배양에 넣을 때 일부 선택이 불가피하다는 것을 알고 있지만, 이러한 초기 발견은 초기 통과 GEM MPNST 배양에서 확인된 돌연변이가 모종양에 존재하는 돌연변이와 매우 유사하게 유지됨을 시사합니다. 그러나, aCGH를 사용하여, 우리는 또한 더 긴 통로를 위해 이러한 초기 통로 배양을 계속 운반하는 것이 이러한 종양 세포의 초기 통로에서 볼 수 있는 것과 다른 게놈 변화를 초래한다는 것을 발견했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 - D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 - S.L.C.) 및 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 - S.L.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
- Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A.
- Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
- Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
- Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
- Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
- Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
- Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
- Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
- Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
- Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
- Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
- Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
- Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
- Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
- Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
- Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
- Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
- Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
- Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
- Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
- Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).
