Identification, diagnostic et classification des tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques dans des modèles murins génétiquement modifiés

Summary

Nous avons développé une méthodologie pour évaluer si les néoplasmes du système nerveux chez les souris génétiquement modifiées récapitulent avec précision la pathologie de leurs homologues humains. Ici, nous appliquons ces techniques histologiques, des critères pathologiques définis et des méthodologies de culture aux neurofibromes et aux tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique survenant dans le modèle murin P 0-GGFβ3.

Abstract

Les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1) développent généralement des neurofibromes plexiformes (NP) qui se transforment ensuite en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) très agressives. La compréhension du processus par lequel une NP se transforme en MPNST serait facilitée par la disponibilité de modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui reproduisent avec précision la progression PN-MPNST observée chez les humains atteints de NF1. Malheureusement, les modèles GEM avec ablation Nf1 ne récapitulent pas complètement ce processus. Cela nous a amenés à développer des souris P 0-GGFβ3, un modèle GEM dans lequel la surexpression de la neuréguline mitogène des cellules de Schwann (NRG1) dans les cellules de Schwann entraîne le développement de PN qui progressent pour devenir des MPNST à haute fréquence. Cependant, pour déterminer si la tumorigenèse et la progression néoplasique chez les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus observés chez les patients NF1, nous avons d’abord dû prouver que la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique P_0-GGFβ3 récapitule la pathologie de leurs homologues humains.

Ici, nous décrivons les méthodologies spécialisées utilisées pour diagnostiquer et classer avec précision les néoplasmes du système nerveux périphérique dans des modèles GEM, en utilisant P 0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3 ; Les souris Trp53^+/- par exemple. Nous décrivons les méthodes histologiques, immunohistochimiques et histochimiques utilisées pour diagnostiquer les NP et les MPNST, comment distinguer ces néoplasmes des autres types de tumeurs qui imitent leur pathologie, et comment classer ces néoplasmes. Nous discutons de l’établissement de cultures à passage précoce à partir de MPNST GEM, de la caractérisation de ces cultures par immunocytochimie et de la vérification de leur tumorigénicité par l’établissement d’allogreffes. Collectivement, ces techniques caractérisent la pathologie des NP et des MPNST qui surviennent dans les modèles GEM et comparent de manière critique la pathologie de ces tumeurs murines à leurs homologues humains.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, de nombreux laboratoires ont tenté de créer des modèles murins de cancers humains en introduisant des mutations associées au cancer humain dans le génome de la souris ou en surexprimant un produit génique surexprimé dans les cancers humains. Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui en résultent peuvent être utilisés à diverses fins, telles que l’établissement que la modification génomique nouvellement introduite initie la tumorigenèse, l’identification d’autres changements génétiques ou épigénétiques ultérieurs qui contribuent à la progression tumorale et la définition des voies de signalisation clés qui conduisent à l’initiation et à la progression de la tumeur. Contrairement aux modèles de xénogreffes orthotopiques, qui reposent sur l’utilisation de souris immunodéficientes, les modèles de cancer GEM ont un système immunitaire entièrement fonctionnel et modélisent donc plus précisément les réponses aux agents thérapeutiques candidats. Cependant, lorsqu’ils utilisent des modèles de cancer GEM à des fins comme celles-ci, il est essentiel que les chercheurs confirment que les observations faites avec les néoplasmes GEM sont pertinentes pour leurs homologues humains. Cette validation doit inclure une évaluation approfondie de la pathologie des tumeurs GEM et une détermination quant à savoir si les caractéristiques pathologiques des tumeurs GEM récapitulent la pathologie du type de tumeur humaine correspondant.

Le syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1) est la maladie génétique la plus courante affectant le système nerveux humain, survenant dans environ 1 naissance vivante sur 3 000 à 3 500 ^1,2,3. Les personnes atteintes de NF1 développent de multiples tumeurs bénignes de la gaine nerveuse périphérique appelées neurofibromes dans leur peau (neurofibromes dermiques) et dans les gros nerfs et plexus nerveux (neurofibromes plexiformes). Alors que les neurofibromes dermiques et plexiformes aggravent la qualité de vie du patient en produisant des troubles physiques, comportementaux et/ou sociaux, les neurofibromes plexiformes (NP) sont particulièrement dangereux ^4,5. En effet, les NP se transforment fréquemment en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST), qui sont des néoplasmes agressifs à cellules fusiformes avec un taux de survie exceptionnellement faible ^1,2. Ce faible taux de survie est dû en grande partie à l’inefficacité des schémas radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques actuellement utilisés pour traiter les TPNM. Cependant, le développement de nouvelles thérapies plus efficaces a été difficile. En effet, malgré la fréquence des MPNST chez les patients atteints de NF1, il s’agit toujours de tumeurs rares. En conséquence, il est très difficile d’obtenir un grand nombre de tumeurs humaines pour l’étude ; il est également difficile de recruter suffisamment de patients atteints de MPNST pour les essais cliniques. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles GEM ont été générés dans le but d’obtenir des informations supplémentaires sur les anomalies à l’origine de la pathogenèse du neurofibrome et de la progression du PN-MPNST et de faciliter les essais précliniques avec des agents thérapeutiques candidats.

Les patients atteints de NF1 présentent des mutations inactivatrices dans une copie du gène NF1. La pathogenèse du neurofibrome est déclenchée lorsqu’une mutation inactivatrice du gène NF1 fonctionnel restant se produit dans une cellule de la lignée cellulaire de Schwann. Étonnamment, cependant, lorsque des souris ont été générées avec des mutations inactivatrices de la lignée germinale Nf1, elles n’ont pas développé de neurofibromes ^6,7. La démonstration ultérieure que les souris avec des cellules de Schwann Nf1-null et une haploinsuffisance Nf1 dans tous les autres types de cellules (Krox20-Cre ;Nf1^flox/- souris) ont développé des neurofibromes plexiformes suggérant qu’une dose réduite du gène Nf1 dans d’autres types de cellules était nécessaire pour la pathogenèse du neurofibrome⁸. Même dans ce cas, les neurofibromes plexiformes de Krox20-Cre ; Les souris Nf1^flox/- n’ont pas progressé pour devenir des MPNST et n’ont donc que partiellement imité la biologie de leurs homologues humains. La pathogenèse des MPNST s’est produite lorsque les mutations de Nf1 étaient associées à des mutations dans d’autres gènes suppresseurs de tumeurs tels que Trp53⁹ ou Cdkn2a¹⁰, mais les MPNST dans ces modèles GEM se sont développés de novo ou à partir de néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUBPs)^11,12, plutôt que de neurofibromes plexiformes bénins préexistants (voir^13,14 pour d’excellentes revues de ces modèles ainsi que d’autres modèles introduisant des mutations de perte de fonction supplémentaires associées à MPNST dans des gènes tels que Suz12 et Pten¹⁵).

Ces modèles murins ont été inestimables pour établir le rôle que jouent des gènes tels que NF1, TP53 et CDKN2A dans la pathogenèse des néoplasmes du système nerveux périphérique associés à la NF1 et pour les essais précliniques testant des agents thérapeutiques candidats. Cependant, nous avons encore une compréhension incomplète du processus par lequel les neurofibromes plexiformes évoluent pour devenir des néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUPP¹⁶) puis des MPNST. Des progrès ont récemment été réalisés dans la compréhension de ce processus avec le rapport récent selon lequel des souris présentant des délétions dans Nf1 et Arf développent des ANNUBP qui progressent pour devenir des MPNST¹¹. Cependant, il n’existe pas encore de modèles murins basés sur la mutation Nf1 qui récapitulent entièrement le processus de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez l’homme. De plus, il n’est pas clair s’il existe plusieurs voies distinctes qui mènent au développement des MPNST. Compte tenu de cela, il est possible que les GEM décrits ci-dessus ne modélisent qu’un sous-ensemble de plusieurs voies différentes qui conduisent à la progression du neurofibrome-MPNST et à la pathogenèse du MPNST. Ce point est souligné par le fait que les MPNST se produisent également sporadiquement et que certains MPNST sporadiques ne présentent apparemment pas de mutations NF1 ^17,18.

Bien que ce dernier point ait été remis en question par la récente suggestion de Magollon-Lorenz et al. selon laquelle au moins certains MPNST sporadiques dépourvus de mutations NF1 sont des mélanomes ou un type différent de sarcome¹⁹, nous avons récemment rapporté un MPNST sporadique et une lignée cellulaire dérivée de cette tumeur (cellules 2XSB) qui était de type sauvage NF1 ²⁰. Lors de la caractérisation de la tumeur mère et de la lignée cellulaire 2XSB, nous avons systématiquement exclu les possibilités de diagnostic alternatives, y compris le mélanome et les multiples autres types de sarcomes qui sont systématiquement pris en compte dans le diagnostic différentiel d’une tumeur maligne sporadique de la gaine nerveuse périphérique²⁰. De plus, nous notons que Magollon-Lorenz et al. ont reconnu que leurs résultats dans les trois lignées cellulaires MPNST sporadiques qu’ils ont étudiées ne pouvaient pas être généralisés pour indiquer que toutes les tumeurs identifiées comme MPNST sporadiques ne sont pas des MPNST.

Pour construire un modèle GEM dans lequel le neurofibrome et la pathogenèse du MPNST ne dépendaient pas nécessairement de mutations spécifiques du gène suppresseur de tumeur, nous avons généré des souris transgéniques chez lesquelles la surexpression de la puissante neuréguline-1 mitogène à cellules de Schwann (NRG1) était entraînée par le promoteur de la protéine de myéline zéro (P₀) spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3)²¹. Nous avons précédemment montré que les neurofibromes humains, les MPNST et les lignées cellulaires MPNST expriment plusieurs isoformes de NRG1 avec les tyrosines kinases du récepteur erbB (erbB2, erbB3 et erbB4) qui médient la signalisation NRG1 et que ces récepteurs erbB sont activés de manière constitutive²². Nous avons également démontré que les inhibiteurs pharmacologiques des kinases erbB inhibent puissamment la prolifération des MPNST²², la survie²³ et la migration²⁴. Conformément à nos observations chez l’homme, les souris P 0-GGFβ3 développent des neurofibromes plexiformes²⁵ qui évoluent pour devenir des MPNST à une fréquence élevée^21,25. Nous avons montré que les MPNST P 0-GGFβ3, comme leurs homologues humains, développent couramment des mutations de Trp53 et Cdkn2a, ainsi que de nombreuses autres anomalies génomiques qui contribuent potentiellement à la tumorigenèse²⁵. Les MPNST apparaissant chez les souris P 0-GGFβ3 ne présentent pas de mutations inactivatrices de Nf1. Cependant, en utilisant la complémentation génétique, nous avons montré que NRG1 favorise la tumorigenèse chez les souris P 0-GGFβ3 principalement par les mêmes cascades de signalisation qui sont altérées par la perte de Nf1 ²⁶ ; cette conclusion est basée sur notre constat que la substitution de la surexpression de NRG1 à la perte de Nf1 en présence d’une haploinsuffisance Trp53 (P 0-GGFβ3 ;Trp53^+/- souris) produit des animaux chez lesquels les MPNST se développent de novo, comme on le voit chez cis-Nf1^+/- ; Trp53^{+/- souris 27}.

Pour obtenir cette information et d’autres démontrant que les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome-MPNST observés chez les humains atteints de NF1, nous avons développé des méthodologies spécialisées pour traiter les tissus de ces animaux, diagnostiquer avec précision leurs tumeurs, classer les MPNST apparaissant chez ces souris, établir et caractériser le passage précoce de P_0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3 ; Trp53^+/- MPNST et comparaison critique de la pathologie des PN et MPNST de P 0-GGFβ3 et de P_0-GGFβ3 ; Trp53^+/- MPNST à celui de leurs homologues humains. Beaucoup de ces méthodologies sont généralisables à d’autres modèles GEM de néoplasie du système nerveux. De plus, plusieurs de ces méthodologies sont plus largement applicables aux modèles GEM dans lesquels les néoplasmes apparaissent dans d’autres sites d’organes. Par conséquent, nous présentons ici une description détaillée de ces méthodologies.

Protocol

Les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par du personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux.

1. Détermination de la pénétrance tumorale et de la survie chez les souris P 0-GGFβ3 et identification des tumeurs chez ces animaux pour une caractérisation plus approfondie

1. Générer la cohorte de souris qui sera évaluée pour la tumorigenèse. Le nombre de souris nécessaires dépend de la pénétrance du phénotype tumoral. Pour compenser de telles pertes, commencez par une cohorte supérieure de 10 à 15 % au nombre final d’animaux souhaité.
   REMARQUE : Nous avons déterminé empiriquement la pénétrance tumorale chez les souris P 0-GGFβ3 dans une cohorte initiale de 50 souris (dont six ont été perdues pour des raisons non liées à la néoplasie (par exemple, les bagarres)⁾²⁵.
2. Évaluez la santé des animaux trois fois par semaine et notez les scores d’état corporel, y compris le poids et les changements de comportement à chaque examen. Éliminer les souris tumorales ou moribondes (voir note ci-dessous) en utilisant l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale. Enregistrer l’âge au décès en jours. Si les tumeurs sont visibles de l’extérieur, notez les dimensions de la tumeur (longueur, largeur et hauteur).
   REMARQUE : Il est essentiel que les animaux ne soient pas autorisés à dépasser la taille maximale autorisée de la tumeur et/ou le critère d’évaluation humain approuvés par l’IACUC.
3. À l’aide de l’âge au décès, établissez une courbe de survie de Kaplan-Meier pour déterminer l’âge moyen au décès et la fourchette de survie.
   REMARQUE : Les souris P 0-GGFβ3 avaient un âge moyen à la mort de 261,5 jours, avec une fourchette de 74 à 533 jours ; 91 % de notre cohorte avait des neurofibromes multiples et 71 % avaient des MPNST²¹.
4. Déterminez si des tumeurs visiblement visibles sont présentes et, si elles le sont, disséquez-les dans des conditions stériles pour établir si la tumeur est associée à un nerf périphérique, puis excisez la tumeur. Dans P 0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3 ; Les tumeurs de la gaine nerveuse périphérique chez les souris Trp53^+/- se trouvent le plus souvent dans les nerfs trijumeau et sciatique. Même si des tumeurs visiblement visibles ne sont pas observées en association avec ces nerfs, fixez et intégrez ces nerfs comme décrit ci-dessous afin qu’ils puissent être examinés pour la présence de micro-tumeurs. Les micro-tumeurs se produisent généralement dans les ganglions associés à ces nerfs.
5. Coupez les tumeurs très visibles en trois morceaux (Figure 1A). Utilisez la pièce 1 pour l’histologie (coupes en paraffine, immunohistochimie et histochimie). Utilisez la pièce 2 pour établir des cultures de passage précoce. Congélation instantanée de la pièce 3 (à l’aide d’azote liquide) pour d’éventuelles expériences futures (par exemple, immunotransferts, isolement de l’ARN et de l’ADN).
6. Fixer la pièce 1 dans du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la nuit à 4 ^°C. Fixer le reste du corps de l’animal par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à 4 °C.

2. Enrobage de paraffine de tumeurs visiblement visibles et préparation de coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine pour l’évaluation diagnostique initiale

1. Enrobage de paraffine de tumeurs visibles,
   1. Après avoir fixé le morceau tumoral 1 pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 %, rincez le tissu en le plaçant dans un volume de PBS au moins 10 fois supérieur au volume du tissu pendant 15 min ; Utilisez le même volume pour tous les rinçages suivants. Répétez deux autres rinçages PBS de 15 minutes, en utilisant un nouveau volume de PBS pour chaque rinçage.
   2. Transférer le morceau de tumeur 1 à 70% d’éthanol. Maintenez le tissu dans de l’éthanol à 70 % pendant 24 h à 4 °C. Si vous le souhaitez, conservez le tissu à long terme dans ces conditions.
      REMARQUE : Les étapes 2.1.1 à 2.1.7 sont fournies à l’intention des chercheurs qui n’ont pas accès à un appareil commercial de traitement des tissus. Si l’investigateur a accès à un processeur de tissus, les tissus seront traités à l’aide d’éthanols et de xylènes classés selon le protocole de l’instrument programmé.
   3. Transvasez le morceau de tumeur 1 à 80% d’éthanol pendant 30 min à température ambiante. Répétez l’incubation pendant 30 minutes supplémentaires dans un volume frais d’éthanol à 80 %.
   4. Transférez le morceau de tumeur 1 à 95% d’éthanol pendant 75 min à température ambiante. Répétez l’incubation deux fois de plus, à chaque fois pendant 75 minutes supplémentaires dans un volume frais d’éthanol à 95 %.
   5. Transférez le morceau de tumeur 1 à 100% d’éthanol et incubez pendant 60 min à température ambiante. Répétez l’incubation de 60 minutes deux fois de plus, en utilisant à chaque fois un nouveau volume d’éthanol à 100 %.
   6. Transférez le morceau de tumeur 1 dans un solvant à base de d-limonène et incubez pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Transférez le morceau de tumeur 1 dans un nouveau volume de solvant à base de d-limonène et incubez pendant 30 à 60 minutes supplémentaires à température ambiante.
   7. Transférer le morceau de tumeur 1 dans un solvant à base de paraffine/d-limonène 1:1 pendant 1 h à 60 ^°C. Jeter le solvant à base de paraffine/d-limonène 1:1 et transférer le morceau de tumeur 1 à 60 ^°C de paraffine et incuber pendant 20 min à 60 ^°C. Répéter l’incubation dans un nouveau volume de paraffine à 60 ^°C une fois de plus pendant 20 min. Incuber le morceau de tumeur 1 dans de la paraffine pendant la nuit à 60 ^°C.
   8. Versez une couche de base de paraffine dans un moule histologique en acier et laissez-la se solidifier. Transférez le morceau de tumeur 1 à la surface de la paraffine de base et immédiatement après le positionnement, couvrez le tissu avec de la paraffine à 60 ^°C et placez la cassette tissulaire au-dessus et en contact avec la paraffine fondue. Transférez le moule sur le côté froid de la station d’enrobage et laissez-le se solidifier pendant 10-15 min.
   9. Retirez le bloc de paraffine avec la cassette de tissu attachée du moule. Utilisez la cassette de tissu attachée pour serrer le bloc dans le microtome pendant la section.
      REMARQUE : Le bloc de paraffine peut maintenant être stocké indéfiniment à température ambiante.
2. Préparez des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine des tumeurs visibles.
   1. Coupez des sections de tissu tumoral de 4 à 5 μm à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames de verre chargées positivement.
   2. Pour effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), déparaffinez les coupes de tissu en incubant les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 10 min à température ambiante. Répétez l’incubation dans un nouveau volume de solvant à base de d-limonène pendant 10 min.
   3. Transférez les lames dans de l’éthanol à 100 % et laissez incuber pendant 5 min à température ambiante. Transférez les lames dans un volume frais d’éthanol à 100 % et incubez encore 5 minutes à température ambiante.
   4. Transférez les lames à 95% d’éthanol et incubez pendant 5 min à température ambiante. Transférez les lames dans un volume frais d’éthanol à 95 % et incubez encore 5 minutes à température ambiante.
   5. Transférer les lames à 70% d’éthanol et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, transférez dans de l’éthanol à 50% et incubez pendant 5 min à température ambiante.
   6. Transférez les lames dans de l’eau distillée et incubez pendant 5 min à température ambiante.
   7. Teintez les lames en les plongeant dans de l’hématoxyline pendant 5 min à température ambiante. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 1 à 2 min. Différencier en trempant les lames 2 à 5 fois dans de l’acide chlorhydrique à 0,5 % dans de l’éthanol à 70 %. Rincer au bain-marie pendant 1 à 2 min. Placer les lames dans de l’éthanol à 95 % avec de l’acide acétique à 0,5 % pendant 10 s.
   8. Colorer les lames avec de l’éosine-Y pendant 30 s à température ambiante, puis transférer les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 min. Nettoyer les échantillons dans un solvant à base de d-limonène pendant 5 min.
   9. Montez les lamelles à l’aide d’un support de montage à base de xylène pendant que la lame est encore humide avec le solvant à base de d-limonène. Laissez le support de montage prendre pendant la nuit.
      REMARQUE : N’utilisez pas de support de montage à base d’eau.
3. Préparez des tissus sans tumeurs visibles, pour identifier les neurofibromes plexiformes et les micro-MPNST. Incorporez les tissus dans de la paraffine, préparez des coupes histologiques et colorez ces coupes avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
   1. Retirez les organes internes et intégrez des parties représentatives de chaque organe dans de la paraffine pour préparer des coupes colorées à l’H&E qui seront examinées pour détecter des signes microscopiques de tumeurs (Figure 1B). Retirez la tête, les membres antérieurs, les membres postérieurs et la queue (Figure 1C). Examiner la moelle épinière et les racines nerveuses in situ à la recherche de signes de tumeurs des racines nerveuses, décalcifier la colonne vertébrale et les côtes et tissus mous associés par immersion dans 0,3 M d’EDTA/4 % de paraformaldéhye (pH 8,0) pendant 48 à 72 h à 4 ^°C ; ensuite, rincez les échantillons avec 1x PBS. À la fin de la décalcification, assurez-vous que la décalcification est complète en essayant de percer la colonne vertébrale avec une aiguille. La décalcification est réussie si l’aiguille pénètre facilement dans l’os sans craquer.
   2. Coupez la colonne vertébrale décalcifiée et les structures associées en blocs qui s’adapteront à une cassette de tissus. Déshydrater à l’aide d’éthanols gradués suivis d’un solvant à base de d-limonène comme décrit aux étapes 2.1.2 à 2.1.7. Incorporer dans la paraffine et préparer des sections de 4 à 5 μm comme décrit aux étapes 2.1.7-2.2.1. Effectuer les colorations H&E comme décrit aux étapes 2.2.2-2.2.9 ; Laissez le support de montage prendre pendant la nuit.

3. Identifier les neurofibromes plexiformes potentiels et effectuer des colorations spéciales pour confirmer les diagnostics

REMARQUE : Nous recommandons fortement d’inclure un pathologiste humain ou vétérinaire expérimenté dans l’évaluation de l’H&E et des colorations spéciales des coupes tumorales GEM.

1. Examinez les lames colorées à l’H&E préparées comme décrit ci-dessus à l’aide de la microscopie à fond clair pour identifier les tumeurs potentielles de la gaine nerveuse périphérique. Étant donné que les neurofibromes et les MPNST surviennent dans les nerfs périphériques, il est important de déterminer si les tumeurs microscopiques sont associées à un nerf périphérique. Identifier les blocs présentant des tumeurs potentielles de la gaine nerveuse périphérique afin que des immunocolorations et d’autres colorations spéciales puissent être effectuées pour confirmer ou infirmer les diagnostics.
2. Distinguer les PN potentiels des MPNST/autres néoplasmes de haut grade en fonction des caractéristiques histologiques observées lors de l’examen en fond clair des coupes colorées par H&E. Les NP humains sont des néoplasmes légèrement hypercellulaires principalement composés de cellules avec des noyaux allongés et souvent ondulés. Dans de nombreuses régions, les cellules sont peu serrées et peuvent être séparées par du matériel extracellulaire myxoïde ; Les PN chez les souris P 0-GGFβ3 ont une apparence similaire. Les mitoses ne sont généralement pas présentes ; si elles le sont et que la tumeur est modérément à fortement hypercellulaire, la tumeur est un MPNST ou un autre type de néoplasme de haut grade (voir ci-dessous).
3. Les NP sont composés d’un mélange de cellules de Schwann néoplasiques et d’autres types de cellules non néoplasiques telles que les mastocytes. Pour confirmer l’identité d’un NP, effectuer des immunocolorations pour les marqueurs de cellules de Schwann S100β et Sox10 et le marqueur de mastocytes CD117 (c-Kit) sur des sections de blocs contenant des NP potentiels identifiés lors de l’examen H&E (voir rubrique 3.4 pour d’autres options de coloration des marqueurs de mastocytes). Effectuer des immunocolorations Ki67 pour confirmer les faibles taux de prolifération.
   REMARQUE : Le tableau 1 énumère les marqueurs antigéniques utilisés pour l’identification systématique des neurofibromes plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), le diagnostic des MPNST et pour une évaluation complète des autres types de cellules présentes dans les neurofibromes ; nous ne colorons ces derniers antigènes que lorsque nous décrivons pour la première fois un nouveau modèle GEM. Consultez la fiche technique du fabricant de l’anticorps pour connaître les conditions recommandées. Notez si la notice du fabricant de l’anticorps recommande la récupération de l’antigène ; Tous les antigènes ne nécessitent pas de prélèvement pour être détectables.
   1. Préparez des sections de 4 à 5 μm à partir des blocs de paraffine sélectionnés et montez-les sur des lames chargées positivement. Déparaffiniser les sections comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.6.
   2. Rincer les sections avec 1x PBS pendant 3 à 5 min.
   3. Si le fabricant d’anticorps recommande la récupération de l’antigène, préparez un tampon de citrate. Mélanger 9 mL de solution d’acide citrique (10,5 g d’acide citrique dans 500 mL d’eau distillée) et 41 mL de solution de citrate de sodium (14,7 g de citrate de sodium dans 500 mL d’eau distillée).
   4. Effectuer le prélèvement d’antigènes en plaçant les lames dans un tampon de citrate pendant 20 minutes dans un cuiseur à riz chauffé.
   5. Transférer les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % / 1x PBS pendant 10 min pour éliminer l’activité de la peroxydase dans les tissus.
      REMARQUE : Préparez cette solution fraîche à chaque fois et n’utilisez pas la solution mère de peroxyde d’hydrogène si elle date de plus de 3-4 mois.
   6. Rincer les sections en 1x PBS.
   7. Bloquer les sections à l’aide d’un tampon de blocage (2% BSA, 0,1% Triton X-100 en 1x PBS) pendant 1 h. Rincez brièvement les lames en 1x PBS.
   8. Ajouter l’anticorps primaire aux coupes de tissus. Préparez les anticorps primaires dans un tampon de blocage dilué. Incuber les lames pendant 2 h à 37 ^°C ou toute la nuit à 4 ^°C.
   9. Lavez les lames en 1x PBS pendant 5 min. Répétez 3x.
   10. Incuber les tissus avec des anticorps secondaires biotinylés pendant 1 à 2 h.
   11. Préparez une solution de diaminobenzidine (DAB) selon le protocole du fabricant et plongez les lames dans la solution pendant 2 à 10 minutes. Laver les lames à l’eau pendant 5 min.
   12. Contre-colorez les sections en les immergeant dans de l’hématoxyline pendant 10-15 min. Exposer à l’eau courante jusqu’à ce qu’elle soit claire. Trempez rapidement les lames dans de l’alcool et rincez les lames dans l’eau.
   13. Déshydrater les lames dans les éthanols classés en les trempant rapidement, 4 à 5 fois par solution, dans de l’éthanol à 70 %, à 95 % d’éthanol, puis à 100 % d’éthanol. Incuber les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 2 min. Incuber les lames dans un deuxième lot de solvant à base de d-limonène pendant 2 min.
   14. Montez les diapositives avec un support de montage à base de xylène.
   15. Examinez les lames par microscopie à fond clair.
   16. Pour l’immunofluorescence, omettre les étapes 3.3.10 à 3.3.15. Au lieu de cela, incubez des tissus avec des anticorps secondaires spécifiques à l’espèce dilués dans un tampon bloquant pendant 1 à 2 heures.
   17. Rincer les lames en 1x PBS pendant 5 min. Répéter 3x.
   18. Montez les lames en utilisant 1x PBS/glycérol.
   19. Examiner les lames à l’aide de la microscopie à fluorescence.
4. Méthode alternative pour colorer les mastocytes : coloration au bleu de toluidine
   1. Préparer une solution mère de bleu de toluidine en dissolvant 1 g de bleu de toluidine O dans 100 mL d’éthanol à 70 %.
   2. Préparer une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 1 % en dissolvant 0,5 g de NaCl dans 50 mL d’eau distillée. Mélanger pour dissoudre. Ajustez le pH à environ 2,0-2,5 en utilisant HCl.
      REMARQUE : Cette solution de NaCl doit être rafraîchie chaque fois que des taches sont effectuées.
   3. Préparer la solution de travail du bleu de toluidine en ajoutant 5 mL de solution mère de bleu de toluidine à 45 mL de solution de NaCl à 1 %. Bien mélanger et s’assurer que le pH est d’environ 2,3.
      REMARQUE : Un pH supérieur à 2,5 entraînera une coloration avec moins de métachromasie. Faites en sorte que cette solution soit fraîche à chaque fois qu’une coloration est effectuée.
   4. Déparaffiniser des sections de 4 à 5 μm montées sur des lames chargées positivement comme décrit aux étapes 2.2.2-2.2.6. Laver les sections déparaffinées à l’eau courante pendant 2 min.
   5. Tremper les sections dans une solution de travail au bleu de toluidine pendant 2-3 min. Laver à l’eau distillée pendant 2 min.
   6. Déshydratez les sections en trempant 10x dans de l’éthanol à 95%. Glisses de trempage dans 100% éthanol 10x. Tremper les diapositives dans de l’éthanol frais à 100 % 10 fois de plus.
   7. Incuber les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 2 min. Incuber les lames dans un deuxième lot de solvant à base de d-limonène pendant 2 min.
   8. Montez les lamelles à l’aide d’un milieu de montage à base de xylène pendant que la lame est encore humide avec un solvant à base de d-limonène.
      REMARQUE : N’utilisez pas de support de montage à base d’eau.
   9. Examinez les lames par microscopie à fond clair. Identifier les mastocytes par la présence de granules violet foncé dans leur cytoplasme. Les autres types de cellules sont colorés en bleu clair.

4. Colorations spéciales pour diagnostiquer les MPNST et exclure les diagnostics alternatifs

1. L’aspect histologique des MPNST humains est très variable et plusieurs types de tumeurs différents ont une apparence similaire à celle des MPNST²⁸. Étant donné que les MPNST sont dérivés de la lignée cellulaire de Schwann, déterminez si la tumeur provient d’un nerf périphérique ou d’une NP bénigne existante par un examen macroscopique ou un examen microscopique en fond clair de coupes colorées par H&E. Bien que les MPNST ne soient parfois pas associés à un nerf périphérique ou à une NP (généralement en raison d’une séparation accidentelle du nerf pendant la dissection, de la destruction de la NP préexistante par une prolifération de MPNST ou parce que la lésion est métastatique), recherchez l’association de la tumeur avec un nerf ou une NP car le diagnostic est moins probable si la tumeur n’est pas associée à un nerf ou à une NP.
2. Préparez des coupes de 4 à 5 μm à partir de blocs de paraffine contenant des MPNST potentiels et montez-les sur des lames chargées positivement comme décrit à l’étape 2.2.1. Déparaffiniser les sections comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.6.
3. Effectuer l’immunohistochimie avec le panel d’anticorps indiqué dans le tableau 2 comme décrit aux étapes 3.3.1 à 3.3.15.
4. Examiner les immunocolorations par microscopie à fond clair. Étant donné que les MPNST démontrent une différenciation schwannienne, recherchez une immunoréactivité uniforme ou inégale pour S100β, nestine et Sox10. Si les tumeurs ne sont pas positives pour ces trois marqueurs, reportez-vous au tableau 2 pour établir le diagnostic.
   REMARQUE : Les MPNST humains et murins peuvent présenter une différenciation divergente. Par exemple, certains MPNST humains présentent une différenciation rhabdomyoblastique focale (ces variantes sont connues sous le nom de tumeurs malignes de Triton) ; bien que ces néoplasmes colorent les marqueurs de Schwanni, ils expriment également des marqueurs musculaires tels que la desmine, MyoD1 et la myogénine. L’immunoréactivité de ces derniers marqueurs ne devrait pas dissuader les chercheurs de diagnostiquer la tumeur comme un MPNST. Bien que plusieurs modèles murins exprimant conditionnellement le gène de fusion SS18-SSX aient été établis pour modéliser la pathogenèse du sarcome synovial²⁹, à notre connaissance, les modèles de sarcome synovial qui génèrent spontanément le transcrit de fusion équivalent ne sont pas connus. Par conséquent, nous ne recherchons pas les transcrits de fusion SS18-SSX dans les tumeurs GEM et nous nous appuyons plutôt sur des profils immunohistochimiques.

5. Classement des MPNST

1. Déterminer si une nécrose tumorale, une caractéristique des MPNST de grade IV de l’OMS, est présente. Pour les MPNST de grade IV, recherchez une hypercellularité importante, une activité mitotique rapide (≥4 mitoses pour 10 champs de haute puissance (40x)) et une atypie cytologique.
   1. En l’absence de nécrose, évaluez la tumeur pour déterminer si une hypercellularité, une activité mitotique rapide et une atypie cytologique sont présentes. Si ces caractéristiques sont toutes présentes en l’absence de nécrose, classer la tumeur comme un MPNST de grade III de l’OMS.
   2. Les tumeurs de grade II de l’OMS sont caractérisées par une cellularité accrue, mais à un degré moindre que les MPNST de grade III et IV de l’OMS. Les noyaux des cellules tumorales d’un MPNST de grade II de l’OMS présentent une augmentation de la taille (plus de 3 fois la taille des noyaux des cellules tumorales dans les neurofibromes) et une hyperchromasie. L’augmentation de l’activité mitotique (<4 mitoses pour 10 champs de haute puissance) est associée aux tumeurs de grade II de l’OMS, mais n’est pas obligatoire.
      REMARQUE : Étant donné que les tumeurs de haut grade progressent généralement à partir de bas grades, des régions de bas grade et de haut grade peuvent être présentes dans le même MPNST. Dans ce cas, le grade de la tumeur est déterminé par la région de grade le plus élevé présente.
      REMARQUE : Il existe une controverse parmi les pathologistes humains quant à savoir si le système de classification de l’OMS décrit ci-dessus est prédictif des résultats des patients et certains de ces pathologistes préfèrent plutôt simplement classer les MPNST comme étant de bas grade ou de haut grade. Dans ce schéma, les MPNST de haut grade présentent une atypie cytologique importante, une activité mitotique rapide (>5 mitoses pour 10 champs de haute puissance) et une hypercellularité marquée avec ou sans nécrose. Les MPNST de bas grade ne sont pas nécrosées mais présentent une activité mitotique, une atypie cytologique et une cellularité intermédiaires entre un MPNST de haut grade et un néoplasme neurofibromateux atypique au potentiel biologique inconnu (ANNUBP). Nous préférons le système décrit ci-dessus car il peut être difficile de faire la distinction entre un ANNUBP et un MPNST de faible qualité pour les chercheurs qui n’ont pas une longue expérience de ces entités.

6. Préparation de cultures decellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce

1. Cultiver des cellules tumorales P 0-GGFβ3 à passage précoce à partir d’un morceau de tumeur frais 2 (étape 1.5, Figure 1A). Maintenez des conditions stériles à partir de ce moment.
   1. Dissociez la tumeur en la coupant en petits morceaux (2-4 mm) et en la hachant dans du DMEM10 (milieu essentiel minimal de Dulbecco) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 2 μmol/L de forskoline et 10 nmol/L de neuréguline 1β (NRG1β) dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm.
   2. Laisser les cellules se développer à partir des fragments de tissu haché à 37 ^°C dans 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les plaques soient confluentes. Changez de support tous les 3-4 jours.
   3. Divisez la culture cellulaire. Retirer le milieu des cellules de vaisselle et laver les cellules de 100 mm avec du PBS ; Retirer et jeter le tissu haché. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % pendant 2 à 5 minutes à température ambiante. Pour favoriser le détachement des cellules, tapotez doucement la plaque et vérifiez le détachement à l’aide d’un microscope optique ; prolonger l’incubation de la trypsine au besoin.
   4. Neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de DMEM10. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min. Retirer le support et ajouter 5 ml de DMEM10 frais à la pastille.
   5. Répartissez la suspension cellulaire dans deux à quatre boîtes de 100 mm contenant du DMEM10. Ne divisez pas les cellules pendant plus de cinq passages (étapes 6.1.3 et 6.1.4) et maintenez-les dans DMEM sans forskoline ni NRG1β. N’oubliez pas de congeler les cellules au passage 2 pour une utilisation future.

7. Vérification de l’identité des cellules MPNST à passage précoce par immunocytochimie

1. Placer des lamelles rondes stériles en verre #1,5 de 18 mm dans les puits des boîtes de culture tissulaire stériles à 6 puits.
   1. Placer la solution de poly-L-lysine/laminine dans les puits dans un volume suffisant pour couvrir la lamelle. Scellez la plaque avec une pellicule plastique pour minimiser l’évaporation. Incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les lamelles 3x avec du PBS stérile.
      REMARQUE : Nous avons tenté de plaquer des cellules MPNST à passage précoce sur des lamelles non revêtues et avons constaté que les cellules n’adhèrent pas bien en l’absence d’enrobage de poly-L-lysine/laminine.
   2. Déposer 10 000 cellules sur la lamelle en ajoutant délicatement 2 mL de suspension cellulaire dans un milieu de croissance dans chaque puits contenant la lamelle. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C avec 5% de CO₂ dans un incubateur de culture tissulaire.
   3. Le lendemain matin, rincez les lamelles pendant 2 x 5 min avec du PBS.
   4. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 18 min à température ambiante.
   5. Rincer les lamelles 3 x 5 min avec du PBS. Si vous le souhaitez, scellez la plaque avec un film plastique et conservez-la à 4 °C à ce stade.
   6. Faire 50 mM de NH₄Cl frais dans du PBS. Tremper les aldéhydes en incubant des lamelles dans 50 mM de NH₄Cl dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
   7. Perméabiliser les cellules en incubant des lamelles dans du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Laver les lamelles pendant 3 x 5 min avec PBS.
   8. Bloquer la liaison non spécifique en incubant des lamelles dans un tampon bloquant (1x PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine, 0,2 % de lait écrémé en poudre et 0,3 % de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante.
   9. Retirez le tampon bloquant et ajoutez des anticorps primaires reconnaissant les marqueurs MPNST présents dans la tumeur mère (généralement S100β, Nestin et Sox10) dilués à la dilution optimale prédéterminée dans le tampon bloquant. Enveloppez la plaque d’un film plastique et laissez incuber à 4 °C pendant une nuit dans une chambre humidifiée.
   10. Laver 3 x 5 min avec du PBS pour éliminer l’anticorps primaire non lié. Ajouter l’anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué dans un tampon bloquant et incuber pendant 1 h à température ambiante. Protéger de la lumière.
   11. Laver 3 x 5 min avec PBS. Incuber les lamelles dans 1 à 5 μg de colorant Hoechst pendant 10 min. Continuer à protéger de la lumière.
   12. Lavez les lamelles avec du PBS pendant 5 min. Montez les lames en utilisant 1:1 1x PBS/glycérol. Image avec un microscope fluorescent.

8. Allogreffe de cellules tumorales à passage précoce pour démontrer la tumorigénicité

1. Cultiver des cellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce dans la confluence DMEM10 à 80 %. Rincez les cellules une fois avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à température ambiante. Traiter les cellules pendant 30 s à 1 min avec une solution de dissociation cellulaire non enzymatique pour les éliminer du substrat. Ajouter 5 mL de DMEM10 pour 1 mL d’un réactif de dissociation cellulaire non enzymatique.
   REMARQUE : La dissociation cellulaire peut prendre beaucoup plus de temps, jusqu’à 10 à 20 minutes. Veuillez vous référer au protocole du fabricant.
   REMARQUE : Ne pas faire pousser les cellules jusqu’à la confluence car cela réduirait l’efficacité de la greffe.
   1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Faire tourner les cellules à 5 × g pendant 5 minutes et les remettre en suspension à une concentration de 1-2 × 10⁶ cellules par 100 μL de DMEM10. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être injectées.
   2. Anesthésier des souris NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) dans la chambre d’induction d’un vaporisateur d’isoflurane. Placez l’animal sur le ventre et stérilisez le site d’injection avec de l’éthanol à 70 %. Laissez le site sécher à l’air libre avant l’injection. Avant l’injection, laissez les cellules revenir à température ambiante.
   3. Injecter 1-2 x 10⁶ cellules par voie sous-cutanée dans le flanc droit. Placez la souris seule dans une cage sans litière et laissez-la récupérer. Assurez-vous que seule une partie de la cage est sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Cela fournit une zone vers laquelle la souris peut se déplacer si elle surchauffe.
      REMARQUE : Nous greffons un minimum de trois souris avec chaque culture à passage précoce, car certaines greffes peuvent ne pas prendre.
   4. Laissez le greffon pousser pendant 15 à 60 jours ; Évaluer la santé des animaux 3 fois par semaine et noter les scores d’état corporel, y compris le poids et les changements de comportement à chaque examen. Éliminez les souris qui ont atteint la taille maximale autorisée du greffon ou les souris moribondes en utilisant l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale. Enregistrer l’âge au décès en jours. Lorsque les tumeurs deviennent visibles de l’extérieur, notez les dimensions de la tumeur (longueur, largeur et hauteur).
      REMARQUE : D’après notre expérience, différentes cultures MPNST à passage précoce greffent avec une efficacité variable et diffèrent par le temps nécessaire à la croissance du greffon. Les animaux ne doivent pas être autorisés à dépasser la taille maximale autorisée de la tumeur et/ou le critère d’évaluation humain approuvés par l’IACUC.
2. Récoltez la tumeur, fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 %, intégrez-la dans de la paraffine et effectuez des colorations H&E comme décrit dans les sections 2.1-2.2.9 pour vérifier que l’allogreffe est une tumeur plutôt qu’un tissu réactif. Si nécessaire, immunocolorez le greffon pour les marqueurs présents dans la tumeur mère.

Results

La figure 2 illustre des exemples de néoplasmes très évidents survenant chez les souris P 0-GGFβ3. Les tumeurs facilement identifiables à l’œil nu peuvent être vues comme des masses distendant des régions du corps, comme le montre la figure 2A (flèche). Pour déterminer si le néoplasme est potentiellement une tumeur de la gaine nerveuse périphérique, il est essentiel d’établir que la tumeur est associée à un nerf périphérique. Dans ce cas, une IRM (Figure 2B) démontre que la tumeur est associée au nerf sciatique (pointe de flèche) ; Cette association a été confirmée après euthanasie de la souris et dissection de la tumeur. Il est à noter qu’une grande taille n’indique pas nécessairement que la tumeur est maligne. Dans ce cas, un examen histologique de la tumeur (Figure 2C) a démontré qu’il s’agissait d’un neurofibrome. Le plus souvent, cependant, les tumeurs grossièrement évidentes ne sont pas identifiées avant la nécropsie de la souris. La figure 2D illustre un grand MPNST charnu qui est apparu dans le plexus brachial de cet animal.

La figure 3 illustre des exemples représentatifs de MPNST et de neurofibromes de souris P 0-GGFβ3 préparés selon les procédures décrites dans la section 1 du protocole. La figure 3A-J illustre dix exemples de MPNST provenant indépendamment de notre colonie de souris P_0-GGFβ3. Notez que l’aspect histologique des MPNST peut être très variable, même entre des MPNST survenant indépendamment chez le même animal. Cette variabilité histologique illustre pourquoi nous confirmons systématiquement le diagnostic des MPNST P 0-GGFβ3 par des colorations immunohistochimiques. Nous soulignons également que d’autres types de tumeurs, apparemment non apparentés, se produisent sporadiquement à faible fréquence dans certaines souches de souris consanguines (par exemple, nous avons rencontré plusieurs fois des lymphomes chez des souris P 0-GGFβ3 porteuses du transgène sur un fond C57BL/6J), soulignant davantage l’importance d’utiliser l’immunohistochimie pour confirmer les diagnostics tumoraux. Malgré la variabilité de leur aspect histologique, les dix tumeurs illustrées dans la figure 3A-J étaient immunoréactives pour S100β et nestine et négatives pour les marqueurs d’autres types de tumeurs. La figure 3K illustre une image représentative d’une colonne vertébrale correctement décalcifiée et des tissus associés. Notez que la moelle épinière, les racines nerveuses, le corps vertébral et le muscle squelettique maintiennent tous leur propre relation anatomique les uns avec les autres. La figure 3L est une image de plus grande puissance du corps vertébral et de la moelle épinière sus-jacente. Comme ce tissu est correctement décalcifié, l’os s’est coupé facilement sans déchiquetage ni pliage, et la moelle osseuse est facilement identifiable dans les espaces de moelle. Si le tissu n’avait pas été décalcifié correctement, il se serait accroché à la lame du microtome et aurait été arraché de la section, causant des dommages importants aux tissus adjacents (moelle épinière, racines nerveuses spinales et muscle squelettique). La figure 3M présente une image représentative d’un neurofibrome apparaissant dans une racine nerveuse dorsale chez une souris P 0-GGFβ3. Notez que cette tumeur est moins cellulaire que les MPNST montrées sur la figure 3A-J. Le diagnostic clé des neurofibromes est qu’ils sont composés d’un mélange complexe de cellules de Schwann néoplasiques et de mastocytes non néoplasiques, de macrophages, de fibroblastes et d’éléments périneuriaux qui infiltrent le nerf et écartent les axones.

La figure 4 illustre des exemples de colorations les plus utiles pour l’identification initiale d’un neurofibrome plexiforme et pour distinguer un neurofibrome plexiforme d’un MPNST. La figure 4A illustre l’immunoréactivité S100β dans un neurofibrome plexiforme P 0-GGFβ3. Il convient de noter que l’immunoréactivité S100β n’est évidente que dans une sous-population de cellules, ce qui est conforme au fait que les neurofibromes sont composés d’un mélange de cellules de Schwann néoplasiques et d’autres éléments non néoplasiques (fibroblastes, mastocytes, macrophages, cellules périneuriales, population cellulaire immunoréactive CD34 mal définie et système vasculaire). Malheureusement, la coloration inégale au S100β ne fait pas la distinction entre les neurofibromes plexiformes et les MPNST, car la coloration au S100β peut être inégale dans les MPNST (la coloration H&E est utile à cette fin, cependant, puisque les MPNST sont généralement plus cellulaires que les neurofibromes plexiformes [voir Figure 3]). Les cellules de Schwann néoplasiques sont également immunoréactives pour la nestine du filament intermédiaire, comme le montre le MPNST P 0-GGFβ3 présenté à la figure 4B. Les cellules de Schwann néoplasiques présentent également souvent une immunoréactivité nucléaire pour le facteur de transcription Sox10, comme le montre un MPNST de la figure 4C. Les caractéristiques utiles pour distinguer les neurofibromes plexiformes des MPNST sont la présence de mastocytes et une immunoréactivité importante pour le marqueur de prolifération Ki67. La figure 4D illustre une coloration d’Unna réalisée sur un neurofibrome plexiforme P 0-GGFβ3 pour mettre en évidence la présence de mastocytes, qui sont facilement identifiables par la coloration violette métachromatique proéminente de leurs granules cytoplasmiques. Les mastocytes ne sont pas présents dans les MPNST. En revanche, l’immunoréactivité de Ki67 est pratiquement inexistante dans les neurofibromes plexiformes, comme le montre la tumeur P 0-GGFβ3 illustrée à la figure 4E. Le marquage nucléaire de Ki67 est généralement présent dans une fraction très élevée de cellules tumorales, comme le montre le MPNST microscopique apparaissant dans le ganglion trijumeau d’une souris P 0-GGFβ3 (Figure 4F).

La figure 5 illustre des exemples de colorations que nous effectuons pour caractériser pleinement la composition cellulaire des neurofibromes dans un modèle GEM nouvellement développé. Bien que les colorations montrées sur cette figure aient été obtenues dans des neurofibromes dermiques humains, elles sont identiques en apparence à ce que nous avons vu dans les tumeurs GEM. L’immunoréactivité de CD117 (c-Kit) est présente dans les mastocytes dans les neurofibromes et a donc une distribution très similaire à celle observée avec les colorants Unna (voir Figure 3A). Des macrophages sont également présents dispersés dans les neurofibromes, comme on le voit avec le marqueur pan-macrophage Iba1 (voir Figure 5D) ; cela inclut les sous-classes de macrophages immunoréactifs pour CD163 et CD86 (voir la figure 5B et la figure 5C, respectivement). Une fraction de l’élément de Schwannian dans les neurofibromes démontre également une immunoréactivité nucléaire pour Sox10. Les fibroblastes peuvent être mis en évidence par leur immunoréactivité pour TCF4. Dans la figure 5G, CD31 marque les éléments vasculaires dans le neurofibrome, tandis que CD34, démontré dans la figure 5H, marque une population dendritique énigmatique de cellules qui ont été suggérées comme étant soit une sous-population de macrophages tissulaires résidents³⁰ , soit une nouvelle population de cellules de gaine nerveuse qui ne sont ni des cellules de Schwann ni des fibroblastes³¹.

La figure 6 est incluse pour permettre la comparaison des neurofibromes plexiformes humains et des MPNST avec les tumeurs observées chez les souris P 0-GGFβ3 et pour fournir des exemples représentatifs de certains des types de tumeurs humaines qui peuvent être confondus avec les MPNST. La figure 6A illustre un neurofibrome plexiforme survenu dans le plexus brachial d’un patient NF1, tandis que la figure 6B présente le MPNST de grade IV de l’OMS qui est apparu dans ce même neurofibrome plexiforme. La figure 6B montre certaines des caractéristiques d’un MPNST de grade IV de l’OMS, notamment une hypercellularité et une atypie cellulaires marquées, une activité mitotique rapide et une nécrose tumorale. À titre de comparaison, la figure 6C montre un MPNST de grade II de l’OMS qui présente une atypie cellulaire significative mais est moins hypercellulaire que le MPNST de grade IV et, bien que des mitoses soient présentes, présente une activité mitotique moindre. La figure 6D illustre un fibrosarcome avec son motif caractéristique en « chevrons » de gaines entrelacées de cellules tumorales. Cependant, ce modèle ne fait pas nécessairement la distinction entre les fibrosarcomes et les MPNST, car certains MPNST auront un schéma similaire. De plus, la vue de puissance plus élevée présentée dans la figure 6E montre une morphologie cellulaire similaire à celle observée dans le MPNST de grade IV de l’OMS présenté dans la figure 6B. La figure 6F illustre un léiomyosarcome. Contrairement à la plupart des MPNST, les léiomyosarcomes sont immunoréactifs aux marqueurs musculaires tels que l’actine et la desmine des muscles lisses. L’immunoréactivité à l’actine des muscles lisses peut cependant varier d’une tumeur à l’autre, certaines tumeurs présentant une immunoréactivité uniforme intense (Figure 6G) et d’autres montrant une immunoréactivité qui montre une variabilité cellulaire au sein de la tumeur (Figure 6H). L’immunoréactivité de la desmine peut également être inégale dans les léiomyosarcomes (Figure 6I). Les mélanomes sont très variables en morphologie, certaines tumeurs étant composées de cellules polygonales (Figure 6J) et d’autres étant composées de cellules fusiformes qui peuvent imiter la morphologie des cellules MPNST. Les mélanomes peuvent être distingués des MPNST par l’immunoréactivité des marqueurs de mélanosomes tels que MART1 (Figure 6K). Cependant, les mélanomes, comme les MPNST, sont souvent positifs pour S100β et Sox10 (Figure 6L).

La figure 7 illustre les caractéristiques pathologiques des MPNST de grade II, III et IV de l’OMS isolés chez des souris P0-GGFβ3. La figure 8 montre des images représentatives de cellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce à faible (figure 7A) et à haute puissance (figure 7B). La tumorigénicité de ces cellules est démontrée à la fois par leur capacité à former des colonies lorsqu’elles sont suspendues dans une gélose molle (Figure 7C) et à former des greffons lorsqu’elles sont allogreffées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéficientes (Figure 7D).

Figure 1 : Flux de travail utilisé pour traiter les tumeurs et autres tissus de souris P 0-GGFβ3. (A) Les tumeurs visiblement visibles sont récoltées et segmentées en trois parties pour 1) la fixation dans du paraformaldéhyde à 4 % suivie d’immunohistochimie et d’histochimie, 2) l’établissement d’une culture de cellules tumorales à passage précoce et/ou d’analyses génomiques, et 3) la congélation instantanée à l’aide d’azote liquide pour l’isolement des protéines, de l’ADN ou de l’ARN. (B) Après l’excision de la tumeur, le corps de la souris est fixé dans du paraformaldéhyde à 4% et les organes internes sont retirés. Ces organes sont prélevés pour un examen histologique afin d’identifier les signes microscopiques de néoplasme et d’autres processus pathologiques. (C) Après l’enlèvement des organes internes, les extrémités (tête, membres, queue) et la peau sont retirées de la carcasse. La colonne vertébrale, les côtes adjacentes et le muscle squelettique adjacent sont décalcifiés à l’aide de 0,3 M d’EDTA/4 % de paraformaldéhyde (pH 8,0). Les tissus décalcifiés sont ensuite enrobés de paraffine et des coupes de tissus préparées pour un examen immunohistochimique et histochimique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives de neurofibromes et de MPNST très évidents chez les souris P 0-GGFβ3. (A) Souris P 0-GGFβ3 avec une grosse tumeur grossièrement évidente sur le flanc droit (flèche). (B) Une IRM de cette souris montre que la tumeur est connectée au nerf sciatique (pointe de flèche) et qu’elle s’est développée à travers le fascia sus-jacent pour se développer dans la sous-cutanée (flèche, masse tumorale en vrac). (C) L’examen microscopique de cette tumeur montre que, malgré sa grande taille, la tumeur est un neurofibrome. (D) Grand MPNST charnu apparu dans le plexus brachial d’une souris P 0-GGFβ3. Barre d’échelle = 100 μm. (C). Abréviations : MPNST = tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique ; IRM = imagerie par résonance magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives des MPNST, de la colonne vertébrale décalcifiée et des neurofibromes préparées comme décrit dans la section 1 du protocole. (A-J) Les MPNST P 0-GGFβ3 excisés et colorés en H&E présentent une variabilité histologique. Toutes les images sont des MPNST d’origine indépendante. Malgré cette variabilité histologique, ces tumeurs ont toutes montré un marquage approprié pour les marqueurs MPNST indiqués dans le tableau 1. Barres d’échelle = 200 μm. (K) Image représentative d’une coupe transversale colorée par H&E de la colonne vertébrale décalcifiée. Sur cette image, les structures suivantes sont facilement visualisées : la moelle épinière ; os vertébral ; les ganglions de la racine dorsale sur la racine nerveuse spinale dorsale ; et muscle squelettique paravertébral. Grossissement 4x. (L) Une image de plus grande puissance de la moelle épinière et de la vertèbre montrée en K montre l’apparence correcte de l’os après décalcification avec cette méthodologie. Grossissement 10x. (M) Image représentative d’un neurofibrome de la racine nerveuse dorsale chez une souris P 0-GGFβ3. Grossissement 40x. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : MPNST = tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique ; H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Coloration diagnostique utilisée pour l’identification initiale des neurofibromes plexiformes et leur distinction par rapport aux MPNST. (A) Immunocolorations pour S100β dans un neurofibrome plexiforme P_0-GGFβ3. Notez que la coloration brune intense de cet antigène n’est présente que dans un sous-ensemble de cellules de cette tumeur, ce qui correspond au fait que les neurofibromes sont composés de cellules de Schwann néoplasiques et de plusieurs autres types de cellules non néoplasiques. (B) Image d’immunofluorescence d’un MPNST P 0-GGFβ3 coloré pour la nestine du filament intermédiaire (rouge) et contre-coloré avec du bisbenzimide (bleu, coloration nucléaire). (C) MPNST coloré pour le facteur de transcription Sox10. Une immunoréactivité intense (brune) est évidente dans les noyaux d’un sous-ensemble de cellules tumorales. (D) Vue à haute puissance d’un neurofibrome plexiforme P 0-GGFβ3 après une coloration d’Unna. Cette coloration produit une coloration métachromatique (violette) des granules dans les mastocytes. Les neurofibromes plexiformes se distinguent des MPNST car ces derniers sont dépourvus de mastocytes. (E, F) Immunohistochimie Ki67 dans (E) un neurofibrome plexiforme P 0-GGFβ3 et (F) un MPNST P_0-GGFβ3. Les deux sections ont été contre-colorées à l’hématoxyline (coloration nucléaire bleue), l’immunoréactivité de Ki67 étant évidente sous forme de coloration nucléaire brune dans ces colorations d’immunoperoxydase. Notez qu’aucune coloration nucléaire brune n’est évidente dans le neurofibrome plexiforme, alors que la plupart des noyaux des cellules tumorales sont positifs dans le MPNST. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images représentatives des immunocolorations utilisées pour identifier les sous-populations de cellules qui composent les neurofibromes. Ces images immunofluorescentes d’un neurofibrome dermique humain ont été colorées pour (A) CD117 (c-Kit ; un marqueur des mastocytes), (B) CD163 (macrophages M2), (C) CD86 (macrophages M1), (D) Iba1 (marqueur pan-macrophage), (E) Sox10 (marqueur des cellules de Schwann), (F) TCF4 (marqueur des fibroblastes), (G) CD31 (marqueur de vascularisation) et (H) CD34 (marque une sous-population distincte et mal comprise de cellules dans les neurofibromes). Grossissement 60x, barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Images représentatives des neurofibromes plexiformes, des MPNST et de certains autres types de tumeurs humaines pris en compte dans le diagnostic différentiel d’un MPNST. (A) Neurofibrome plexiforme survenant dans le plexus brachial d’un patient NF1, montrant la cellularité globale inférieure et l’aspect bénin de ce néoplasme. Bien qu’il ne soit pas facile de visualiser les coupes colorées par H&E, un mélange complexe de types cellulaires est présent. Les mitoses ne sont pas visibles. Grossissement : 40x. (B) Un MPNST de grade IV de l’OMS qui est apparu à la suite du neurofibrome plexiforme illustré en A. Notez le degré de cellularité beaucoup plus élevé. La flèche indique une figure mitotique, et l’astérisque indique une région de nécrose tumorale dans la partie supérieure droite de ce champ microscopique. Grossissement : 40x. (C) Un MPNST OMS grade II. Cette tumeur a un degré de cellularité inférieur à celui du MPNST de grade IV de l’OMS illustré en B. Cependant, il y a plus d’atypie nucléaire et d’hyperchromasie que ce qui est évident dans le neurofibrome plexiforme illustré en A. La flèche indique l’une des figures mitotiques occasionnelles rencontrées dans cette tumeur. Grossissement : 63x. (D) Une vue à faible puissance d’un fibrosarcome de type adulte illustrant le motif « chevrons » (les gaines entrelacées des cellules tumorales) généralement observé dans ce type de tumeur. Malheureusement, l’architecture à chevrons est également rencontrée dans certains MPNST humains et ne peut donc pas être utilisée pour distinguer les fibrosarcomes des MPNST. Notez la similitude entre la morphologie cellulaire de ce fibrosarcome et la morphologie cellulaire évidente dans le MPNST de grade IV de l’OMS montré en B. Grossissement : 40x. (F) Image haute puissance d’un léiomyosarcome, démontrant une morphologie cellulaire qui se situe dans la gamme de variation observée dans les MPNST. Grossissement : 40x. (G) Immunocolorations pour l’actine des muscles lisses dans le léiomyosarcome illustré en F. Notez que les cellules tumorales présentent une immunoréactivité intense uniforme pour cet antigène. Grossissement : 40x. (H) Immunocolorations pour l’actine des muscles lisses dans un léiomyosarcome différent. Dans cette tumeur, il existe une plus grande variabilité dans le degré d’immunoréactivité, certaines cellules se colorant plus intensément que d’autres. Il n’est pas rare que l’immunoréactivité d’un même antigène soit uniformément présente dans une tumeur et qu’elle ne soit présente que dans un sous-ensemble de cellules tumorales d’un néoplasme différent. Grossissement : 40x. (I) Immunocoloration pour la desmine dans un troisième léiomyosarcome. Dans cette tumeur, seul un sous-ensemble de cellules tumorales est intensément immunoréactif pour cet antigène. (J) Mélanome métastatique. Les mélanomes sont connus pour avoir une morphologie très variable qui peut aller du cuboïde au fuseau ; les tumeurs de cette dernière morphologie sont plus susceptibles d’être confondues avec les MPNST, d’autant plus que les mélanomes et les MPNST peuvent présenter une immunoréactivité S100β et Sox10. Grossissement : 40x. (K) Immunoréactivité pour le marqueur de mélanome MART1 dans la tumeur illustrée en J. Grossissement : 40x. (L) Immunoréactivité nucléaire pour le facteur de transcription Sox10 dans le mélanome montré en J. Grossissement : 40x, barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Images représentatives des MPNST de grade II-IV P 0-GGFβ3 de l’OMS. (A) Photomicrographies de faible puissance et (B) de haute puissance d’un MPNST de grade II de l’OMS. Notez que la cellularité est inférieure à celle du MPNST de grade III de l’OMS illustré dans le panneau C et que les noyaux des cellules tumorales dans D sont plus hyperchromatiques (plus foncés) que ceux observés dans le panneau B. (C) Photomicrographies de faible et (D) de haute puissance d’un MPNST de grade III de l’OMS. Cette tumeur présentait >4 figures mitotiques pour 10 champs de haute puissance, avec des cellules plus denses et des noyaux atypiques plus hyperchromatiques. (E) Vues de faible et (F) de forte puissance d’un MPNST de grade IV de l’OMS. Notez le foyer de nécrose dans la partie centrale inférieure du panneau F. Faible puissance = 20x. Haute puissance = 40x, barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Images représentatives des cellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce et leur tumorigénicité démontrées par la croissance dans la gélose molle et leur capacité à se développer en tant qu’allogreffes. (A) Images en contraste de phase à faible et (B) haute puissance des cellules MPNST P_0-GGFβ3 à passage précoce. (C) Cellules MPNST_{P 0-GGFβ3} cultivées en gélose molle et colorées au noir du Soudan ; Les colonies sont évidentes sous forme de puncta noir dans l’agar. (D) Image colorée à l’hématoxyline et à l’éosine d’une tumeur qui s’est formée après que des cellules MPNST P 0-GGFβ3 aient été allogreffées par voie sous-cutanée chez une souris immunodéficiente comme décrit dans le protocole. (E) Prolifération de cellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce sur une période de 5 jours, déterminée par un cytomètre d’image Celigo. Faible puissance = 10x, haute puissance = 40x ; barre d’échelle = 100 μm pour tous les panneaux Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom	Usage	Réactivité/classe des espèces
CD117	Prédilué	lapin monoclonal
CD163	1:200	monoclonle de souris
CD31	1:50	polyclonal de lapin
CD34	1:2000	lapin monoclonal
CD86	1:1000	lapin monoclonal
Cytokératine	1 μg/mL	souris monoclonale
Desmin	1:50	souris monoclonale
Iba1	1:500	lapin polyclonal
Ki-67	1:50	lapin monoclonal
MART1	1 μg/mL	souris monoclonale
Nestin	1:1,000	souris monoclonale
Le	1:100	Rabbot monoclonal
S100B	1:200	polyclonal de lapin
SMA	1:100	souris monoclonale
Sox10	1:10	souris monoclonale
TCF4/TCFL2	1:100	lapin monoclonal

Tableau 1 : Anticorps utilisés pour le diagnostic du neurofibrome plexiforme et des tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique. Anticorps utilisés pour l’identification systématique des neurofibromes plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), le diagnostic des MPNST et une évaluation complète des autres types de cellules présentes dans les neurofibromes. Abréviation : MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique.

		S100β	Nestin	Sox10	MART1	Le	Desmin	Actine des muscles lisses	Cytokératine	SS18-SSX Fusion
MPNST		50-90%, généralement focale	Positif1	~30 %	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif
Fibrosarcome		Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif
Léiomyosarcome		Rare	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	50-100%	Positif	~40 %	Négatif
Sarcome épithéloïde		Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Positif	Négatif
Mélanome		Positif	Positif	85%	Positif	Positif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif
Sarcome synovial monophasique		~30 %	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Positif	Positif

Tableau 2 : Marqueurs utilisés pour établir l’identité tumorale chez l’homme. Ces marqueurs immunohistochimiques et histochimiques, ainsi qu’une évaluation de la morphologie microscopique de la tumeur, sont utilisés pour distinguer les MPNST des autres néoplasmes qui les imitent. Le diagnostic différentiel généralement envisagé pour les MPNST humains comprend le fibrosarcome de type adulte, le sarcome épithéloïde, le léiomyosarcome, le sarcome synovial monophasique et le mélanome. Les fibrosarcomes de type adulte ont un motif à chevrons au microscope et se colorent pour la vimentine, mais pas pour S100β. Les léiomyosarcomes, mais pas les MPNST, sont immunoréactifs à la desmine ; Les léiomyosarcomes ont également des noyaux avec une morphologie particulièrement émoussée. Les sarcomes épithéloïdes, mais pas les MPNST, sont immunoréactifs à la cytokératine. Les mélanomes, comme les MPNST, peuvent être positifs pour S100β, mais sont également immunoréactifs pour MART-1 et PMEL. Abréviation : MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique. ¹La combinaison de S100β et de nestine est hautement prédictive du MPNST.

Discussion

Les méthodes histologiques et biochimiques présentées ici fournissent un cadre pour diagnostiquer et caractériser les modèles GEM du neurofibrome et de la pathogenèse MPNST. Au fil des ans, nous avons constaté que ces méthodologies étaient très utiles pour évaluer la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique apparaissant dans les modèles GEM 21,25,26. Cependant, bien que les protocoles décrits ici soient utiles pour déterminer avec quelle précision les tumeurs dans les modèles GEM récapitulent la pathologie de leurs homologues humains, il y a certaines limites à ces stratégies qui doivent être appréciées. Pour commencer, les souris P 0-GGFβ3 présentent une pénétrance presque complète de leur phénotype tumoral, ce qui rend relativement facile l’obtention d’un grand nombre de souris atteintes de neurofibromes et de MPNST 21,25,26 qui peuvent être utilisés pour des études génomiques et des criblages shRNA à l’échelle du génome. La pénétrance élevée du phénotype dans ce modèle rend également les souris P 0-GGFβ3 très utiles pour les essais précliniques. Il faut toutefois reconnaître que ce ne sera pas le cas pour tous les modèles de cancer GEM. C’est pourquoi nous avons souligné l’importance de déterminer la fraction d’animaux dont on peut prédire qu’ils développeront des tumeurs. Lorsque nous travaillons avec un modèle animal qui développe moins fréquemment des tumeurs, nous avons trouvé avantageux d’utiliser des modalités d’imagerie telles que l’imagerie par résonance magnétique ou la tomographie par émission de positrons pour identifier définitivement les animaux porteurs de tumeurs qui peuvent être soumis à des essais précliniques ou à d’autres études. Cette approche peut toutefois être prohibitive si des analyses répétées sont nécessaires. C’est pourquoi nous avons également souligné l’importance d’établir le temps de survie moyen du modèle GEM d’intérêt²⁶ - comprendre quand on peut s’attendre à ce qu’un animal développe une tumeur réduit le nombre de scans nécessaires pour identifier les animaux avec le phénotype souhaité et les coûts associés.

Il est également important de reconnaître qu’une grosse tumeur chez une souris est encore en fait une assez petite quantité de tissu. Dans ce protocole, nous recommandons un processus dans lequel le tissu tumoral est divisé en tiers, avec des parties consacrées à l’histologie/immunohistochimie, à l’établissement de cultures cellulaires à passage précoce et à l’isolement de biomolécules (protéines, ARN, ADN) d’intérêt. Cependant, la taille de la tumeur varie et si la tumeur est assez petite, cela peut empêcher d’avoir suffisamment de tissu pour se diviser de cette manière. Dans ce cas, l’investigateur doit déterminer si le diagnostic de la tumeur ou une autre utilisation du tissu tumoral est prioritaire³². Dans ces circonstances, notre parti pris est que nous devons avoir un diagnostic approprié pour comprendre avec quoi nous travaillons avant de nous lancer dans d’autres expériences. Nous avons constaté que les diagnostics tumoraux peuvent généralement être facilement établis en utilisant moins d’un tiers du néoplasme. Lorsqu’il s’agit de petites tumeurs, nous retirons généralement un petit fragment de tissu tumoral, l’enveloppons dans un tissu histologique et le plaçons dans une cassette tissulaire pour nous assurer que le tissu n’est pas perdu pendant le traitement. L’inconvénient de cette approche est qu’elle peut amener l’investigateur à sous-classer le néoplasme si la classification de l’OMS est souhaitée ; En effet, les régions de bas grade et de grade supérieur coexistent couramment dans les cancers et, si un très petit échantillon est prélevé, le grade obtenu dépendra de l’endroit où l’échantillon de tumeur a été prélevé.

Les protocoles que nous décrivons pour établir l’identité tumorale de la gaine nerveuse périphérique reposent fortement sur l’immunohistochimie. Bien qu’il existe des approches alternatives occasionnelles qui peuvent être utilisées pour certains types de cellules (par exemple, effectuer des colorations Unna pour identifier les mastocytes), ce n’est pas uniformément vrai pour la plupart des types de cellules présentes dans les neurofibromes et les MPNST. Par conséquent, il faut prendre grand soin d’établir que les procédures immunohistochimiques qui seront utilisées ont été correctement optimisées. D’après notre expérience, plusieurs problèmes peuvent compromettre l’immunohistochimie diagnostique. Il est extrêmement important que le chercheur effectue une série de dilutions avec un anticorps primaire qu’il n’a jamais utilisé auparavant ; De plus, une série de dilutions doit être effectuée lors de l’utilisation d’un nouveau lot d’un anticorps qui a été préalablement optimisé³³. Il faut également veiller à ce que des lots de réactifs frais soient à portée de main. D’après notre expérience, lorsqu’ils vieillissent, le peroxyde d’hydrogène et le DAB sont particulièrement susceptibles de ne pas fonctionner correctement, ce qui peut amener l’enquêteur à décider de manière inappropriée que leurs taches sont négatives.

Les profils immunohistochimiques que nous décrivons pour les neurofibromes plexiformes, les MPNST et les divers types de néoplasmes qui sont pris en compte dans le diagnostic différentiel des MPNST sont ceux que nous avons le plus souvent rencontrés 21,25,26,34. Cependant, comme une différenciation divergente n’est pas rare dans les MPNST et ces autres tumeurs malignes, l’investigateur peut rencontrer des profils de coloration qui diffèrent quelque peu de ce que nous décrivons ici. Ces nuances sont la raison pour laquelle nous recommandons fortement que l’équipe caractérisant un nouveau modèle GEM de tumorigenèse inclue un pathologiste humain ou vétérinaire expérimenté. Dans ce protocole, nous avons appliqué la classification de l’OMS aux GEM et aux MPNST humains. Nous préférons ce système de notation car les critères de notation sont relativement bien définis et sont faciles à comparer entre les MPNST humains et murins ^2,28. Nous notons cependant que les critères de classement de l’OMS ne sont pas uniformément acceptés par les pathologistes. En effet, il n’est pas clair que les trois grades de l’OMS appliqués aux MPNST soient prédictifs des résultats cliniques chez les patients. Pour cette raison, de nombreux pathologistes préfèrent classer les MPNST simplement comme des tumeurs malignes de bas grade ou de haut grade. En utilisant cette approche, environ 85 % des MPNST sont considérés comme des tumeurs malignes de haut grade caractérisées par une activité mitotique rapide, une atypie cellulaire marquée et une hyperchromasie pouvant être accompagnée d’une nécrose tumorale. Les MPNST de bas grade présentent moins de cellularité, d’hyperchromasie et d’activité mitotique.

Nous avons constaté que l’allogreffe de cellules MPNST à passage précoce est un moyen simple de vérifier la tumorigénicité de ces cultures. Cependant, certains problèmes doivent être pris en compte lorsque les cellules n’établissent pas d’allogreffe³². D’après notre expérience, alors que l’écrasante majorité des cellules MPNST à passage précoce établiront une allogreffe, nous avons parfois rencontré des cultures à passage précoce qui ne le font pas. Malgré cet échec, l’hybridation génomique comparative sur puce (aCGH) et le séquençage de l’exome entier ont démontré que ces cultures à passage précoce présentaient de multiples anomalies génomiques compatibles avec le fait qu’il s’agissait de cellules tumorales^25,26. Nous avons également trouvé des cultures à passage précoce qui ne sont pas saines, généralement parce qu’on les a laissées confluentes avant de les récolter pour la greffe. Les cellules endommagées par une manipulation brutale (par exemple, incubées trop longtemps avec une solution de dissociation cellulaire non enzymatique pipetée de haut en bas un nombre excessif de fois) fonctionnent également mal lorsqu’elles sont greffées. Nous notons également que les délais que nous avons indiqués pour l’établissement de la greffe sont une estimation basée sur notre expérience. À l’occasion, nous avons rencontré des cultures à passage précoce qui réussiront à établir des allogreffes mais prendront plus de temps à le faire.

Les approches décrites ci-dessus fournissent un moyen complet de caractériser les aspects clés d’un nouveau modèle GEM de néoplasie du système nerveux périphérique et de diagnostiquer correctement les neurofibromes et les MPNST développés par ces animaux. Les méthodes que nous décrivons pour établir des cultures MPNST à passage précoce et utiliser ces cultures pour l’allogreffe fournissent également des preuves claires de la tumorigénicité des néoplasmes identifiés dans les modèles GEM. Nous tenons à souligner que nous n’effectuons pas la sélection de clones individuels lors de l’établissement de cultures de passage précoce. Bien que nous reconnaissions qu’une certaine sélection est inévitable lors de la mise en culture de cellules tumorales, ces premiers résultats suggèrent que les mutations identifiées dans les cultures GEM MPNST à passage précoce restent très similaires à celles présentes dans la tumeur mère. Cependant, en utilisant l’aCGH, nous avons également constaté que le fait de continuer à porter ces cultures de passage précoce pour des passages plus étendus entraîne des changements génomiques qui commencent à diverger de ce qui est observé dans les passages antérieurs de ces cellules tumorales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaques de culture tissulaire de 100 mm	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
Plaques à 6 puits	Corning Costar	3516
Acide acétique	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondaire (anti-souris de chèvre)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (anti-souris pour chèvre)	Invitrogen	A21043 ou A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (anti-lapin)	Invitrogen	A11036
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Kit de dosage des protéines BCA	Thermo Scientific	23225
Albumine	sérique bovineFisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM  ;	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM  ;	ab29364
CD34	ABCAM  ;	ab81289
CD86	ABCAM  ;	ab53004
Racleur cellulaire	Sarstedt	83.183
Décapant cellulaire	Corning	25-056-CI
Couvre-lame circulaire	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybride (solvant à base de d-limonène)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokératine	ABCAM  ;	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako  ;	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Sérum de veau fœtal	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycérol	Sigma-Aldrich	G6279
saline équilibrée de Hank (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hémacytomètre	Brightline-Hauser Scientific	1490
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144-212
Peroxyde d’hydrogène	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (peroxydase) Kit polymère ,souris sur souris	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (peroxydase) Kit polymère, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubateur	Thermo Scientific	Heracell 240i Incubateur
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Signalisation cellulaire  ;	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Azote
MART1	ABCAM  ;	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore  ;	Humain : MAD5236 (10C2), Humain : MAB353 (Rat-401)
Neuréguline 1 bêta	Fabriqué	en interne Fabriqué par S.L.C. (également disponible sous le nom de 396-HB-050/CF chez R& D Systems)
Neurofibromine	Santa Cruz Biotechnology  ;	SC-67
SIGNE DE TÊTE. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ souris	Jackson Laboratory	5557
Lait écrémé en poudre	Walmart	Great Value Brand
P0-GGF&beta ; 3 souris	Maison
Cire de paraffine	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldéhyde (4 %)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Médium de montage au xylène)	Fisher Scientific	SP15-100
PH-mètre	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Saline tamponnée au phosphate (Dulbecco’s)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM  ;	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance	Machine VetEquip Systèmes d’Anesthésie
PVA-DABCO (Milieu de Montage Aqueux)	Millipore Sigma	10981100ML
Cuiseur à Riz	Hêtre Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  ; (aujourd’hui GA504)
SMA	Ventana Medical Systems  ;	clone 1A4
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S640
Citrate de sodium (dihydraté)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM  ;	ab212843
			d’histologie en acier
Superfrost Plus Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2  ;	Signalisation cellulaire  ;	(CH48H11) #2569
Cassette
Bleu toluidine	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsine	Corning	25-051-31