Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bærbar papirbasert immunoassay kombinert med smarttelefonapplikasjon for kolorimetrisk og kvantitativ påvisning av Dengue NS1-antigen

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/66130
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 4,5
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

Summary

For å adressere presserende dengue-diagnostiske behov, introduserer vi her en smarttelefonapp-integrert Dengue NS1 papirbasert analytisk enhet (DEN-NS1-PAD) for kvantifisering av Dengue NS1-antigenkonsentrasjon i kliniske serum / blodprøver. Denne innovasjonen forbedrer dengue-ledelsen ved å hjelpe klinisk beslutningstaking i ulike helsetjenester, selv ressursbegrensede.

Abstract

Dengue virus (DENV) infeksjon, som overføres av Aedes mygg, er et stort folkehelseproblem i tropiske og subtropiske land. Med en årlig forekomst på ca. 10 millioner tilfeller og 20 000-25 000 dødsfall, spesielt blant barn, er det et presserende behov for praktiske diagnostiske verktøy. Tilstedeværelsen av dengue ikke-strukturelt protein 1 (NS1) under tidlig infeksjon har vært knyttet til cytokinfrigivelse, vaskulær lekkasje og endoteldysfunksjon, noe som gjør det til en potensiell markør for alvorlig dengue.

Papirbaserte immunoassays som laterale strømningsanalyser (LFA) og mikrofluidiske papirbaserte analytiske enheter (PAD) har fått popularitet som diagnostiske tester på grunn av deres enkelhet, hurtighet, billighet, spesifisitet og enkle tolkning. Imidlertid er konvensjonelle papirbaserte immunoassays for dengue NS1-deteksjon vanligvis avhengige av visuell inspeksjon, noe som bare gir kvalitative resultater. For å løse denne begrensningen og forbedre følsomheten, foreslo vi en svært bærbar NS1 dengue-deteksjonsanalyse på en papirbasert analytisk enhet (PAD), nemlig DEN-NS1-PAD, som integrerer en smarttelefonapplikasjon som en kolorimetrisk og kvantitativ leser. Utviklingssystemet muliggjør direkte kvantifisering av NS1-konsentrasjoner i kliniske prøver.

Serum- og blodprøver tatt fra pasienter ble brukt til å demonstrere systemets prototypeytelse. Resultatene ble oppnådd umiddelbart og kan brukes til klinisk vurdering, både i velutstyrte helseinstitusjoner og ressursbegrensede innstillinger. Denne innovative kombinasjonen av en papirbasert immunoassay med en smarttelefonapplikasjon gir en lovende tilnærming for forbedret deteksjon og kvantifisering av dengue NS1-antigen. Ved å øke følsomheten utover evnen til det blotte øye, har dette systemet stort potensial for å forbedre klinisk beslutningstaking i dengue-ledelse, spesielt i fjerntliggende eller underbetjente områder.

Introduction

Denguevirus (DENV) infeksjon er den raskest spredende myggbårne sykdommen1, og mer enn 390 millioner mennesker er smittet med 96 millioner symptomatiske infeksjoner, 2 millioner tilfeller av alvorlig sykdom, og mer enn 25.000 dødsfall per år forekommer i verden 1,2. Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) er anslagsvis 3,9 milliarder mennesker i fare for dengue; ~ 70% bor i Asia Pacific-landene og hovedsakelig i Sørøst-Asia3. I 2019 var antall dengue-tilfeller rapportert til WHO 4,2 millioner, og Thailand bidro med minst 136 000 dengue-tilfeller og 144 dødsfall fra dengueinfeksjon4. Dengue-utbruddet i Thailand skjer i regntiden, fra april til desember, i både urbane og landlige områder, spesielt i det nordøstlige området.

DENV-infeksjoner har forskjellige kliniske manifestasjoner som spenner fra subkliniske symptomer, mild denguefeber (DF) til alvorlig dengue hemoragisk feber (DHF). Hovedkarakteristikken for alvorlig DHF-tilstand er økt vaskulær permeabilitet etterfulgt av sjokk og organdysfunksjon1. Å forstå den molekylære banen som kan forårsake vaskulær lekkasje er svært viktig for å utvikle effektive dengue-behandlinger. Dengue ikke-strukturelt protein 1 (NS1) er et utskilt glykoprotein under tidlig virusinfeksjon 5,6, og det fungerer som en kofaktor for viral RNA-replikasjon7. NS1 kan utløse cytokinfrigjøring og bidra til vaskulær lekkasje ved å binde seg til tolllignende reseptor 4 (TLR4) og endotelial glykokalyks 8,9. In vitro-forskning har vist at NS1 interagerer med endotelceller og induserer apoptose. Denne tilstanden kan bidra til endoteldysfunksjon og vaskulær lekkasje10. NS1-antigennivåer, korrelert med serum interleukin (IL)-10-nivåer, økte signifikant hos pasienter med alvorlig klinisk sykdom11. Dengue NS1 bidrar også til sykdomspatogenese ved å indusere IL-10 og undertrykke DENV-spesifikke T-celleresponser12,13. I tillegg var dengue NS1-protein relatert til alvorlig klinisk sykdom, og konsentrasjonen av NS1 > 600 ng ml-1 i de første 3 dagene av sykdommen var assosiert med utviklingen av DHF14.

Persistensen av dengue NS1-antigenet hos pasienter med DHF kan brukes som markør for alvorlig dengue6. Det finnes flere metoder for å påvise NS1 i kliniske prøver som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og hurtigtest15. Gullstandarden for måling av konsentrasjonen av NS1-proteiner i en klinisk setting er ELISA-metoden. ELISA-metoden er imidlertid kostbar og krever faglært personell og laboratoriefasiliteter16. Derfor pågår utviklingen av teknologi for påvisning og kvantifisering av NS1-proteiner i pasientnær test (POCT) fortsatt. I det siste tiåret har papirbaserte immunoassays som laterale strømningsanalyser (LFA) og mikrofluidiske papirbaserte analytiske enheter (μPAD) blitt populære som diagnostiske tester på grunn av deres enkelhet, hurtighet, billighet og spesifisitet 17,18,19. I en papirbasert immunoassay har flere etiketter blitt brukt til å generere signaler, for eksempel gull nanopartikler (AuNPs) 20, magnetiske nanopartikler21,22, kvanteprikker23 og fluorescensmaterialer 24,25. AuNP er de vanligste etikettene som brukes i papirbaserte immunoassays på grunn av deres billige produksjonskostnader, enkel produksjon, stabilitet og enkel avlesning. For tiden brukes laterale strømningsanalyser (LFAer) for dengue NS1 i klinisk setting26,27. Imidlertid bruker konvensjonell LFA-etikettdeteksjon vanligvis det blotte øye og gir bare kvalitative resultater.

I løpet av det siste tiåret har mer enn 5 milliarder smarttelefoner blitt mye brukt globalt, og det er potensial for å utvikle bærbar deteksjon28,29. Smarttelefoner har multifunksjonelle kapasiteter som innebygde fysiske sensorer, flerkjerneprosessorer, digitale kameraer, USB-porter, lydporter, trådløs og applikasjonsprogramvare, noe som gjør dem egnet for bruk i forskjellige biosensorplattformer30. I tillegg tillater trådløs teknologi at data sendes raskt og kan brukes til sanntids- og overvåking på stedet31. Mudanyali et al. kombinerte papirbasert immunoassay og smarttelefoner for å utvikle en bærbar, utstyrsfri, rask, billig og brukervennlig POCT-plattform for malaria, tuberkulose og HIV32. Ling et al. rapporterte en lateral strømningsanalyse kombinert med et smarttelefonkamera for å oppdage alkalisk fosfataseaktivitet i melk kvantitativt33. Hou et al. utviklet også et smarttelefonbasert, dual-modalitetsbildesystem for kvantitative signaler fra farge eller fluorescens i lateral flow assay34. I tillegg kan bruk av smarttelefonen som en kolorimetrisk og kvantitativ leser forbedre følsomheten mens det blotte øye ikke trygt kan rapportere tilstedeværelsen av målet35.

DEN-NS1-PAD 36,37,38 (heretter referert til som enheten) presenterer et gjennombrudd innen denguediagnostikk, og tilbyr en bærbar og effektiv løsning. Ved hjelp av vokstrykt mikrofluidisk papirbasert teknologi kvantifiserer denne enheten NS1 med høy følsomhet og spesifisitet gjennom bildebehandling. For å forbedre nytten ytterligere har vi utviklet en brukervennlig smarttelefonapp for kolorimetrisk og kvantitativ lesing. Klinisk validering ved hjelp av pasientprøver fra thailandske sykehus understreker den umiddelbare effekten på pasientvurdering i sanntid. Vår innovasjon markerer et sentralt fremskritt innen strømlinjeformet, point-of-care-dengue-ledelse, og lover å revolusjonere diagnostikk i ressursbegrensede helselandskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den etiske komiteen i Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) ga godkjenning. I gjennomføringen av denne studien fulgte vi alle nødvendige etiske forskrifter.

1. Enhetsfabrikasjon av den papirbaserte Immunoassay

MERK: Den papirbaserte immunoassay-enheten ble produsert etter tidligere etablerte metoder36,37, og Thai patentforespørsel nr. 19010081638.

  1. Design og mønstertegning: Design papiranalytisk enhet (figur 1A, B) med 18 PAD voksmønstre på en datamaskin.
    MERK: Designet er spesifikt og beregnet på papir i A5-størrelse. Antall PAD-er er relatert til størrelsen på papiret, som brukeren krever.
  2. Skriv ut det designede mønsteret på cellulosepapiret ved hjelp av en voksskriver (materialfortegnelse).
  3. Smelt det voksprintede papiret i en laboratorieovn i 75 s ved 150 °C. Deretter lagrer du den i en silikaboks til det er nødvendig for de påfølgende trinnene.
  4. Påfør 0,5 μL 0,025% poly-L-lysin (PLL) på både test- og kontrollområdene. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 2 minutter i en silikaboks og varm deretter opp i ovnen ved 65 °C i 5 minutter.
  5. Påfør 0,5 μL av 1 μg μL-1 geitanti-mus IgG-antistoff på kontrollområdet og 0,5 μL av 1 μg μL-1 av fangstantistoffet til testområdet. La dråpene tørke i en silikagelboks ved RT i 30 minutter.
  6. Påfør 2 μL av blokkeringsbufferen på prøveområdet, 3 μL på konjugatområdet og 2 μL på deteksjonsområdet. La dråpene tørke ved RT i en silikagelboks i 30 min.
  7. Påfør 2 μL gull nanopartikkel-antistoffkompleks (AuNPs-Ab) løsning til konjugatområdet og la det tørke i en silikagelboks ved RT i 30 minutter.

2. Montering av den papirbaserte immunoanalysen

  1. Fjern forsiktig beskyttelsesfilmen på baksiden av det selvklebende plastbakkortet for å eksponere limet.
  2. Juster det behandlede cellulosepapiret med det selvklebende plastbakkortet og trykk de to lagene godt sammen.
    MERK: Unngå å berøre det hydrofile feltet for å minimere risikoen for forurensning eller skade på enheten.
  3. Påfør en plastfilm for å belegge papiret og trykk dem sammen.
  4. Klipp ønsket stykke enheter ved hjelp av saks fra ark med fullstendig monterte enheter.
  5. DEN-NS1-PAD-ene (figur 1C) er nå klare til bruk. For langsiktig stabilitet, oppbevar dem ved 4 °C.

3. Fremstilling av AuNPs-Ab-konjugatet

MERK: AuNPs-Ab ble utarbeidet som beskrevet tidligere av Prabowo et al.36.

  1. Kombiner 10 μL 1 mg ml-1 anti-NS1 antistoff i PBS, 1 ml 40 nm AuNPs kolloid og 0,1 ml 0,1 M boratbuffer (pH 8,5).
  2. Roter blandingen ved 50 o / min i 60 minutter og inkuber ved RT.
  3. Påfør 0,1 ml 10 mg ml-1 BSA i BBS, roter ved 50 o / min, og inkuber ved RT i 15 minutter.
  4. Sentrifuger oppløsningen ved 20 187 × g og 4 °C i 30 minutter.
  5. Forsiktig pipette og separer supernatanten fra den utfelte AuNPs-Ab.
  6. Resuspender AuNPs-Ab i 500 μL BBS og spred den ved hjelp av sonikering.
  7. Gjenta sentrifugeringen ved 20 187 × g og 4 °C i 30 minutter.
    MERK: Gjenta dispersjons- og sentrifugeringsprosessene 3x.
  8. Tilsett 50 μL av konjugatbufferen til suspensjonen, noe som gjør den klar for påføring på konjugatområdet.

4. Utvikling av mobilapplikasjoner

  1. Utvikling av bildebehandling og maskinlæring
    1. Samle et datasett for en overvåket bildemodell ved å samle over 900 autofokusbilder av DEN-NS1-PAD-er, fange ulike forhold som forskjellige konsentrasjoner, kameramerker (12-13 megapiksler), rotasjoner (90 ° og 180 °) og lysinnstillinger. Sikt på 30 bilder under hver spesifikke tilstand.
    2. Merk grunnsannheten ved å identifisere og kommentere to interesseområder som test- og kontrollområdene i de innsamlede bildene for veiledet læring.
    3. Design en algoritme for å identifisere bakgrunnsstripen. Finn midtlinjen mellom test- og kontrollområdene, beregn midtpunktet og opprett et kvadratisk område proporsjonalt med gjennomsnittsstørrelsen for de to hovedområdene, samtidig som du beholder samme rotasjonsretning.
    4. Opprett en bildesegmenteringsmodell ved hjelp av datasettet og bakkesannhetsetikettene fra trinn 4.1.1 og 4.1.2 for å lære opp en bildesegmenteringsmodell for å identifisere interesseområdene.
  2. Søknad algoritme
    1. Bruk den opplærte bildesegmenteringsmodellen på nye bilder for å finne test-, kontroll- og bakgrunnsområdene automatisk.
    2. Bruk grunnleggende bildebehandlingsteknikker for å få én enkelt intensitetsverdi for hvert av de tre interesseområdene (test, kontroll og bakgrunn).
    3. Transformer bildet til en 3D-array-representasjon (y, x-kanal) for å få tilgang til bildepunktverdier.
    4. Konverter bildet til gråtoner ved å beregne et gjennomsnitt av RGB-verdier, og bruk inversjon med formelen (255-x).
    5. Normaliser verdiene i test- og kontrollområdet ved å trekke fra bakgrunnsområdeverdien.
    6. Bruk den forhåndsinnstilte kalibreringskurven til å beregne konsentrasjonen av NS1.
    7. Klassifiser resultatene som positive eller negative basert på en grenseverdi på 0,1103 avledet fra normaliserte gråtoneintensiteter37.

5. Kalibreringskurve og følsomhet

  1. Klargjør NS1-prøve i humant serum for kalibrering med konsentrasjoner på 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,0 μg ml-1.
  2. Slipp 50 μL av hver konsentrasjon på prøveområdet og utfør målinger i tre eksemplarer.
  3. La prøvene veke helt inn i enheten, noe som kan ta 20-30 minutter å oppnå resultater.
  4. Ta bilder av enheten ved hjelp av et digitalt kamera eller smarttelefon etter 5 min inkubasjon.
  5. Analyser test- og kontrollområdene ved hjelp av ImageJ og et tilpasset mobilprogram.
  6. Konstruer kalibreringskurven basert på data fra ImageJ og mobilapplikasjonen.
  7. Beregn grensen for tom (LOB), deteksjonsgrensen (LOD) og kvantifiseringsgrensen (LOQ) ved hjelp av ligninger (1-3) nedenfor:
    LOB = Gjennomsnittet av tomme data + 1:645* ð (standardavvik for tomme data) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (standardavvik for data om laveste konsentrasjon) (2)
    LOQ = Gjennomsnitt av tomme data + 10*ð (standardavvik for tomme data) (3)

6. Utføre en papirbasert immunoassay med kliniske prøver

  1. Samle og behandle 300 μL perifert blod fra 30 pasienter på den første dagen av sykehusinnleggelse i lilla topp EDTA-rør, etter god klinisk praksis.
  2. Sentrifuger blodet ved 2 884 × g og 4 °C i 20 minutter.
  3. Overfør væskekomponenten (plasma) til et rent polypropylenrør ved hjelp av en pipette.
  4. Oppbevar plasmaet i fryseren umiddelbart ved -20 °C for senere analyse.
  5. Påfør 20 μL plasma på prøveområdet på toppen av enheten. Deretter tilsettes 30 μL vaskebuffer (0,05% v/v mellom 20 i 1x fosfatbufret saltvann).
  6. La prøven veke helt inn i enheten, noe som kan ta 20-30 minutter å oppnå resultatene.
  7. Ta bilder av enheten ved hjelp av et digitalt kamera eller smarttelefon etter 5 min inkubasjon ved romtemperatur.
  8. Analyser test- og kontrollområdene ved hjelp av ImageJ og et tilpasset mobilprogram.

7. Kvantifisering med mobilapplikasjon

MERK: Intensiteten av papirbasert immunoassay analyseres i mobilapplikasjonen (figur 2).

  1. Åpne den utviklede mobilapplikasjonen på smarttelefonen.
  2. Velg Bruk kamera eller Last opp fra galleri for å velge eller laste opp datakilden. Gjør dette gjennom kameraopptak eller ved å velge et bilde fra enhetens galleri.
  3. Naviger til analyseseksjonen og trykk på Analyser-knappen på skjermen.
  4. Vent til applikasjonen analyserer dataene og viser resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Valg av fabrikasjonsmetode er avgjørende for å sikre reproduserbare analyseytelser i papirbaserte immunoassay-enheter. I vår studie utforsket vi ulike produksjonsprosesser og materialer i sammenheng med å demonstrere en papirbasert immunoassay. Vår valgte metode benytter et voksutskriftssystem for å skape hydrofobe barrierer i papirbaserte mikrofluidiske enheter. Denne tilnærmingen skiller seg ut på grunn av sin enkelhet, hastighet og konsistente resultater. Merk at det gir fordelen av å unngå bruk av fotoresistkjemikalier, som har potensial til å forstyrre proteinadsorpsjon og øke hydrofobisiteten til cellulosepapir. Videre sikrer vokstrykk konsistente dimensjoner av fluidiske kanaler, noe som bidrar til repeterbar analyseytelse.

Etter dannelsen av hydrofobe barrierer ble de nødvendige reagensene for immunoassay påført cellulosepapiroverflaten. Med elektrostatisk adsorpsjon assisterte PLL i biomolekylimmobilisering ved å interagere med både den positive ladningen av aminfunksjonelle grupper og det negativt ladede antistoffet. Dette trinnet letter modifikasjon og immobilisering av antistoffer og anvendelse av etikett-antistoffkonjugater under fabrikasjonsprosessene. Det er viktig at dette trinnet kan gjennomføres parallelt. Monteringen av papirimmunoassay-enhetene (DEN-NS1-PAD, som vist i figur 1A) fullføres ved å stable det modifiserte papiret på et selvklebende plastbakkort og laminere det med en plastfilm.

Hovedformålet med denne studien er å utvikle en brukervennlig metode som bruker en smarttelefon for å måle NS1-konsentrasjoner. Denne tilnærmingen kan brukes som en point-of-care testing (POCT) enhet i både hjem og kliniske innstillinger. Gitt det brede spekteret av NS1-konsentrasjoner i pasientserum, ble enkle lineære modeller brukt basert på resultatene av disse forsøkene. For hver NS1-konsentrasjon ble det utarbeidet et datasett bestående av tre testenheter. Bilder av enhetene ble tatt med en smarttelefon under standardinnstillinger og optimale lysforhold, noe som eliminerte behovet for en mørk boks. Testsonen til PADs inneholder mus dengue NS1 monoklonalt antistoff, mens kontrollsonen har geit anti-mus IgG antistoff. Med et sandwichanalyseformat tilsvarer høyere NS1-konsentrasjoner i prøver økt intensitet av rød farge i testsonen. I motsetning til dette forblir fargeintensiteten i kontrollsonen relativt konstant. Figur 1B viser ubehandlede smarttelefonbilder, som gir en fordelaktig visuell observasjon uten behov for spesialutstyr.

Ved hjelp av en dedikert mobilapplikasjon normaliserte vi intensitetene og beregnet enkle lineære modeller for piggete NS1-konsentrasjoner i serumprøver - koeffisientkorrelasjonen (r2) hentet fra mobilapplikasjonen. Koeffisientkorrelasjonen (r2) hentet fra mobilapplikasjonen var 0,92 (figur 3), i samsvar med forventningene. Denne smarttelefonbaserte tilnærmingen overgikk observasjon med det blotte øye, og økte følsomheten betydelig med 178%. I tillegg ble grensen for blank (LoB), deteksjonsgrense (LoD) og kvantifiseringsgrense (LoQ) beregnet for normaliserte intensiteter, som presentert i tabell 1.

Kliniske prøver fra den virkelige verden ble brukt til å demonstrere den praktiske funksjonaliteten til DEN-NS1-PADs i kliniske omgivelser. Den papirbaserte immunoassay produserte kvalitative fargeavlesninger innen 20-30 minutter, noe som muliggjorde visuell bestemmelse av negative eller positive resultater. Serumprøver fra pasienter mistenkt for dengue ble eksponert for apparatet. Figur 4 illustrerer og sammenligner resultatene fra både enheten og en kommersiell hurtigdiagnostisk test (RDT). Tabell 2 oppsummerer resultatene av visuelle avlesninger og det smarttelefonbaserte systemet. Den kommersielle RDT og enheten ga lignende resultater, med syv positive og 23 negative utfall fra visuell lesing. I motsetning til dette rapporterte det smarttelefonbaserte lesersystemet utelukkende på enheten ni positive og 21 negative utfall fra kliniske prøver.

Figure 1
Figur 1: Bilder av designet og fabrikkert DEN-NS1-PAD. (A,B) En enkelt kanal fra den voksmønstrede hydrofobe barrieren er designet og avbildet i tre tilstander (C) før og (D,E) etter å ha introdusert prøveløsningen til det angitte området og vist henholdsvis (D) negative og (E) positive resultater. Prøveløsningen veker gjennom kanalen (se pilen merket), interagerer med komponentene på nøkkelsteder-AuNPs-Ab i konjugatområdet, anti-NS1-antistoff ved testområdet (indikerer et positivt dengue NS1-resultat) og anti-mus IgG ved kontrollområdet. Resultatene er lett observerbare med det blotte øye og kan kvantifiseres ved bildebehandling ved hjelp av en planskanner eller smarttelefonkamera. Forkortelse: AuNPs-Ab = gull nanopartikler-antistoff konjugat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjermbilder av telefonens skjerm fra mobilappen. (A) Brukerskjermen til Android-applikasjonen som kjører på mobiltelefonenheten, (B) visning av applikasjonsskjermen, (C) hovedmenyen til applikasjonen som brukerne kan velge for å bruke kamera eller laste opp bilde fra galleriet, (D) visning av et relatert bilde for testing, (E) visning av nedtellingstiden for å analysere, (F) visning av testresultater, inkludert intensiteten av testen og kontrollsonen, infeksjonsbeslutningen (positiv/negativ) og konsentrasjonen av NS1 i prøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lineær kalibreringskurve for NS1-deteksjon i serum. Enheten ble brukt og bilder tolket ved behandling via en applikasjon basert på smarttelefondata. Feilfeltene viser ±1 standardavvik, n = 3. Forkortelser: T = testområde; C = kontrollområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bilde av DEN-NS1-PAD fra klinisk prøveanalyse. Serum (50 μL) ble brukt i et papirbasert immunoassay. (A) Negativt resultateksempel, (B) positive resultater, (C) generelle resultater og sammenligning av RDT versus papirbasert immunoassay. Forkortelser: RDT = Rapid Diagnostic test; Pos = positiv; Neg = negativ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Parameter Blotte øyne Mobilapp
Grense for tom (LoB) - 43,15 ng ml-1
Grense for deteksjon (LoD) 200 ng ml-1 112,19 ng ml-1
Grense for kvantifisering (LoQ) - 373,58 ng ml-1

Tabell 1: LoB, LoD og LoQ fra ImageJ og mobilapplikasjon på datakalibreringsstandard NS1 i serum. Forkortelser: LoB = grense for blank; LoD = deteksjonsgrense; LoQ = kvantifiseringsgrense.

Pasient nr. Blotte øyne Smarttelefon-appen BildeJ
RDT Papirbasert immunanalyse
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - -
4 - - - -
5 - - - -
6 - - - -
7 - - - -
8 - - - -
9 + + + +
10 - - + +
11 - - - -
12 + + + +
13 - - - -
14 - - - -
15 - - - -
16 + + + +
17 + + + +
18 - - - -
19 - - - -
20 - - - -
21 + + + +
22 + + + +
23 - - - -
24 + + + +
25 - - - -
26 - - - -
27 - - - -
28 - - - -
29 - - - -
30 - - + +

Tabell 2: Sammenligning av visuell lesing og smarttelefonbaserte lesersystemresultater for serumprøver. (+) og (-) indikerer henholdsvis positive og negative tolkninger av resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En av de viktige designparametrene for et smarttelefonbasert lesersystem er muligheten til å gi reproduserbar bildebehandling av prøver. I denne studien, for enkelhet og bekvemmelighet, ble bildene tatt fra tre forskjellige smarttelefonmerker med 12-13 MP kameraer uten å bruke en bildeboks eller tilbehør. Varierende forhold for bildeopptak, for eksempel kameraets oppløsning, tid for bildeopptak, lysforhold og miljø, kan påvirke fargeintensiteten til test- og kontrollpunktene på enheten. Virkningen av forskjellige bildeopptakstider på belysning og tørking av PAD på signalintensiteten til enhetene ble minimert ved å bruke de normaliserte signalintensitetene, som forble konsistente på tvers av bilder tatt på forskjellige tidspunkter36. Bakgrunnssignalsubtraksjon dukket opp som en strategi for å forbedre nøyaktigheten av fargeintensitetsmålinger, og effektivt redusere påvirkningen av lysforhold. Vårt funn stemmer overens med tidligere forskning som fremhever effekten av baseline eller bakgrunnssubtraksjonsteknikker for å minimere miljøeffekter 39,40.

Den pågående debatten rundt overlegenheten ved å bruke en bildeboks eller en tilbehørsfri metode har implikasjoner for bildebehandling39,41. En bildeboks kan forbedre robustheten til bildebehandlingsresultater ved å minimere variasjoner i bildeforholdene 41,42,43. I denne studien benyttet vi en mobilapplikasjon basert på skymaskinlæring for bildebehandling. Denne tilnærmingen utnytter maskinlæring i en skybasert plattform for å klassifisere, trekke ut og berike bildedata automatisk. Programmet identifiserte og behandlet effektivt interesseområdet i bilder, som omfatter bakgrunns-, test- og kontrollsoner. Dette trinnet var sentralt i å skille mellom disse sonene38. Tidligere forskning tyder på at bildebehandling som involverer maskinlæring gir overlegen klassifisering mellom utfall for kontroll- og testprøver 43,44,45. I denne studien genererte bruk av fast plassering og bakgrunnssubtraksjon et konsistent bakgrunnssignal fra cellulose-μPAD-ene, noe som forbedret konsistensen og klassifiseringsnøyaktigheten av avlesningene levert av mobilapplikasjonen40,43.

Når det gjelder de konsekvente ytelsene ved å demonstrere en papirbasert immunoassay, spiller fabrikasjonsmetoden en viktig rolle. I en tidligere studie36 ble flere optimaliseringsbetingelser for design- og fabrikasjonsmetoden til DEN-NS1-PAD, for eksempel konsentrasjoner av PLL, blokkerende substans og NS1-antistoff, studert. Enheten testet NS1 i buffer, cellekultur og humant serum både kvalitativt og kvantitativt.

Matriseeffekter som stammer fra serumkomponenter kan forstyrre deteksjonsgrensen til enheten ved testing av serumprøver. Resultatene indikerer imidlertid at den utviklede immunoassay kunne lykkes med å oppdage NS1-konsentrasjoner i serumprøver, noe som gir resultater som er sammenlignbare med de kommersielle RDT (tabell 2). De tilsynelatende resultatene ved hjelp av visuell inspeksjon og mobilapplikasjonen (figur 4) ble observert, noe som understreket analysens effektivitet for serumtesting. Selv om serumets høyere viskositet kan påvirke analysetiden, hindrer det ikke resultattolkning36. Bruk av en mobilapplikasjon kan gi mer positive resultater for prøveanalyser fordi bruk av en mobilapplikasjon forbedrer følsomheten til prøvetestingbetydelig 46. Det er verdt å merke seg at ytterligere sammenligninger med molekylære analyser som RT-PCR 15,47,48 for dengue NS1 er nødvendig for å bestemme potensielle falske positive eller falske negative resultater.

En bemerkelsesverdig begrensning av denne studien oppstår når man vurderer en mer kompleks prøvematrise som blod. Komponentene som er tilstede i blod kan faktisk forstyrre deteksjonsgrensen til enheten. I slike tilfeller representerer bruk av ekstra absorberende pads for å forbedre løpende bufferabsorpsjon en potensiell løsning. Denne modifikasjonen kan hjelpe blodkoagulasjon, utnytte celluloseens hemostypiske egenskaper ved å påvirke blodplater49. En annen tilnærming innebærer å bruke 4% (w / v) saltvannsdråper til prøveputen for å forbedre blodkoagulasjonen. Tidligere forskning har vist at salter som kalsiumklorid og natriumklorid induserer koagulasjon av røde blodlegemer (RBC)50,51. Na + kan destabilisere suspensjonen av RBC i blodet ved å undertrykke det elektriske dobbeltlaget på RBC-overflaten og redusere ladningsfrastøtningen mellom RBC. I tillegg induserer en høy konsentrasjon av salt også blodaggregering52. Videre undertrykker motionvalensladningen til Na + tykkelsen på det ladede dobbeltlaget av RBC, noe som fører til aggregering av de deflaterte RBC-ene. Tilsetning av 4 % (w/v) saltoppløsning (NaCl) letter plasmaseparasjonen på cellulosepapir51. Imidlertid er forsiktig optimalisering av saltvannskonsentrasjonen nødvendig for å unngå å indusere uønskede effekter på blodaggregering og gull nanopartikkelaggregering53,54.

Kommersielle voksskrivere ga en ideell kombinasjon av kostnad og enkel prototyping. Da disse skriverne ble avviklet i 2016, var det nødvendig med alternative fabrikasjonsmetoder som blekkskriver55, silketrykk56 og fotolitografi57. En kontortonerskriver er en god kandidat for fremstilling av μPAD. Polyesterharpiksen i toneren skaper hydrofobe mønstre ved 200 °C i 60 minutter med ulike design58.

Antistoff NS1 serotype to, som spesifisert av selskapet, ble brukt i denne undersøkelsen. Vi fant imidlertid at dette antistoffet også interagerer med alle serotyper36,37. Sensitiviteten for påvisning av DENV-4 er lavere (87,5 %) sammenlignet med andre serotyper. Sensitiviteten til DENV-1 og DENV-2 er ca. 88,89%, og for DENV-3 er 100%37. Disse funnene stemmer overens med tidligere forskning, som også rapporterte lavere følsomhet av RDT til DENV-4 sammenlignet med andre serotyper59. Den totale følsomheten til enheten er ~ 88, 89%, med en spesifisitet på ca. 86, 67%. Det er bemerkelsesverdig at den faktiske følsomheten til DEN-NS1-PAD kan overgå den kommersielle RDT. RDT viser imidlertid en positiv prediktiv verdi (PPV) på 84,62 % og en nøyaktighet på 87,67 %. Spesielt utførte DEN-NS1-PAD bedre i å oppdage dengueinfeksjon i de første 5-6 dagene, mens RDT bare er effektiv i de første 5 dagene37.

Oppsummert, kombinere en bærbar papirbasert immunoassay (DEN-NS1-PAD) med en smarttelefonapplikasjon holder stort løfte om dengue NS1-måling. Den mobile applikasjonen forbedrer sensitiviteten og effektiviteten betydelig ved å kvantifisere NS1 i serumprøver sammenlignet med observasjon med det blotte øye. Mobilapplikasjonens fordeler inkluderer redusert analysetid, brukervennlighet og kompatibilitet med forskjellige smarttelefonenheter, posisjoner og lysforhold. Imidlertid er det behov for ytterligere forbedring for å forbedre følsomheten og ytelsen. I mellomtiden er modifikasjon av papirbasert immunoassay nødvendig for å forbedre ytelsen når det gjelder blodprøver. Videre er det nødvendig med omfattende evalueringer av DEN-NS1-PAD for påvisning av dengue ved bruk av et mer signifikant antall primære infeksjonsserotyper og utvalgte prøver samlet inn fra ulike pasienter (barn og voksne).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

M.H.P. takker stipendforskningsfondet fra Universitas Islam Indonesia (UII). Forfatterne uttrykker sin takknemlighet til Mr. Nutchanon Ninyawee for hans verdifulle ekspertise og assistanse gjennom utviklingen av mobilapplikasjonen og hans bidrag til manuskriptet. Videre setter forfatterne pris på den økonomiske støtten fra Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (prosjekt nr. FRB660073/0164) under Program Smart Healthcare of King Mongkut's University of Technology Thonburi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein   the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA  the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid Merck 10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)   PAA Lab GmbH (Germany) K41-001 
Casein Merck 9005-46-3
Chromatography paper Grade 2  GE Healthcare 3002-911 
Clear laminate film 3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate Merck 7558-79-4
Double tape side Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody  MyBiosource (USA) MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody   Merck AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834236
NS1 serotype 2 antigens MyBiosource (USA) MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t elution buffer
Plastic backing card 10x30 cm Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL) Sigma Aldrich P4832
Potassium Chloride Merck 104936
Potassium monophosphate Merck 104877
Sodium Chloride Merck 7647-14-5
Sodium tetraborate  Sigma Aldrich 1303-96-4
Sucrose Merck 57-50-1
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader BioTek
Mobile phones Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner Epson Perfection V30
Oven Memmert
Wax printer  Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation Google Cloud
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
  2. World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
  3. WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
  4. Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
  5. Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
  6. Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
  7. Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
  8. Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
  9. Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
  10. Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
  11. Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
  12. Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
  13. Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
  14. Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
  15. World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
  16. Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
  17. Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
  18. Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
  19. Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
  20. Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
  21. Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
  22. Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
  23. Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
  24. He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
  25. Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
  26. Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
  27. Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
  28. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
  29. Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
  30. Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
  31. Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
  32. Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
  33. Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
  34. Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
  35. You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
  36. Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
  37. Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
  38. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
  39. Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
  40. Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
  41. Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
  42. Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
  43. Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
  44. Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
  45. Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
  46. Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
  47. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
  48. Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
  49. Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
  50. Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
  51. Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
  52. Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
  53. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
  54. Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
  55. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
  56. Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
  57. Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
  58. Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
  59. Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 203 Dengue NS1 mikrofluidisk papirbasert analytisk enhet smarttelefon applikasjon kolorimetrisk analyse
Bærbar papirbasert immunoassay kombinert med smarttelefonapplikasjon for kolorimetrisk og kvantitativ påvisning av Dengue NS1-antigen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prabowo, M. H., Chalermwatanachai,… More

Prabowo, M. H., Chalermwatanachai, T., Surareungchai, W., Rijiravanich, P. Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen. J. Vis. Exp. (203), e66130, doi:10.3791/66130 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter