Summary
لتلبية الاحتياجات التشخيصية العاجلة لحمى الضنك ، نقدم هنا جهازا تحليليا ورقيا مدمجا في تطبيق الهاتف الذكي Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) لقياس تركيز مستضد حمى الضنك NS1 في عينات المصل / الدم السريرية. يعزز هذا الابتكار إدارة حمى الضنك من خلال المساعدة في اتخاذ القرارات السريرية في مختلف أماكن الرعاية الصحية ، حتى تلك التي تعاني من محدودية الموارد.
Abstract
تعد عدوى فيروس حمى الضنك (DENV) ، التي تنتقل عن طريق البعوض الزاعجة ، مصدر قلق كبير للصحة العامة في البلدان المدارية وشبه المدارية. مع حدوث ما يقرب من 10 ملايين حالة سنويا و 20,000-25,000 حالة وفاة ، خاصة بين الأطفال ، هناك حاجة ملحة لأدوات التشخيص العملية. تم ربط وجود بروتين حمى الضنك غير الهيكلي 1 (NS1) أثناء العدوى المبكرة بإطلاق السيتوكين وتسرب الأوعية الدموية والخلل البطاني ، مما يجعله علامة محتملة لحمى الضنك الشديدة.
اكتسبت المقايسات المناعية الورقية مثل فحوصات التدفق الجانبي (LFAs) والأجهزة التحليلية الورقية الدقيقة (PADs) شعبية كاختبارات تشخيصية نظرا لبساطتها وسرعتها وعدم تكلفتها وخصوصيتها وسهولة تفسيرها. ومع ذلك ، فإن المقايسات المناعية الورقية التقليدية للكشف عن حمى الضنك NS1 تعتمد عادة على الفحص البصري ، مما يؤدي إلى نتائج نوعية فقط. لمعالجة هذا القيد وتعزيز الحساسية ، اقترحنا مقايسة NS1 المحمولة للغاية للكشف عن حمى الضنك على جهاز تحليلي ورقي (PAD) ، وهو DEN-NS1-PAD ، الذي يدمج تطبيق الهاتف الذكي كقارئ لوني وكمي. يتيح نظام التطوير القياس الكمي المباشر لتركيزات NS1 في العينات السريرية.
تم استخدام عينات المصل والدم التي تم الحصول عليها من المرضى لإثبات أداء النموذج الأولي للنظام. تم الحصول على النتائج على الفور ويمكن استخدامها للتقييم السريري ، سواء في مرافق الرعاية الصحية المجهزة تجهيزا جيدا أو في الأماكن المحدودة الموارد. يوفر هذا المزيج المبتكر من المقايسة المناعية الورقية مع تطبيق الهاتف الذكي نهجا واعدا لتعزيز الكشف عن مستضد حمى الضنك NS1 وتحديده كميا. من خلال زيادة الحساسية بما يتجاوز قدرات العين المجردة ، يحمل هذا النظام إمكانات كبيرة لتحسين عملية صنع القرار السريري في إدارة حمى الضنك ، لا سيما في المناطق النائية أو المحرومة.
Introduction
عدوى فيروس حمى الضنك (DENV) هي أسرع الأمراض التي ينقلها البعوضانتشارا 1 ، وأكثر من 390 مليون شخص مصابون ب 96 مليون إصابة مصحوبة بأعراض ، و 2 مليون حالة من الأمراض الوخيمة ، وأكثر من 25000 حالة وفاة سنويا تحدث فيالعالم 1.2. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، فإن ما يقدر بنحو 3.9 مليار شخص معرضون لخطر حمى الضنك. ~ 70٪ يعيشون في دول آسيا والمحيط الهادئ وبشكل رئيسي في جنوب شرق آسيا3. في عام 2019 ، بلغ عدد حالات حمى الضنك التي أبلغت بها منظمة الصحة العالمية 4.2 مليون حالة ، وساهمت تايلاند بما لا يقل عن 136000 حالة حمى الضنك و 144 حالة وفاة من عدوى حمى الضنك4. تحدث فاشية حمى الضنك في تايلاند خلال موسم الأمطار ، من أبريل إلى ديسمبر ، في كل من المناطق الحضرية والريفية ، وخاصة في المنطقة الشمالية الشرقية.
لعدوى حمى الضنك مظاهر سريرية مختلفة تتراوح من الأعراض دون السريرية وحمى الضنك الخفيفة (DF) إلى حمى الضنك النزفية الوخيمة (DHF). السمة الرئيسية لحالة DHF الشديدة هي زيادة نفاذية الأوعية الدموية تليها صدمة وخلل وظيفي في الأعضاء1. إن فهم المسار الجزيئي الذي يمكن أن يسبب تسرب الأوعية الدموية مهم جدا في تطوير علاجات فعالة لحمى الضنك. بروتين حمى الضنك غير الهيكلي 1 (NS1) هو بروتين سكري مفرز أثناء الإصابة المبكرة بالفيروس 5,6 ، ويعمل كعامل مساعد لتكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي7. يمكن أن يؤدي NS1 إلى إطلاق السيتوكين والمساهمة في تسرب الأوعية الدموية عن طريق الارتباط بالمستقبل الشبيه بالرقم 4 (TLR4) والجليكوكاليكس البطاني 8,9. أظهرت الأبحاث في المختبر أن NS1 يتفاعل مع الخلايا البطانية ويحفز موت الخلايا المبرمج. يمكن أن تسهم هذه الحالة في اختلال وظيفي في البطانة وتسرب الأوعية الدموية10. زادت مستويات مستضد NS1 ، المرتبطة بمستويات مصل الإنترلوكين (IL) -10 ، بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من مرض سريري شديد11. يساهم حمى الضنك NS1 أيضا في التسبب في المرض عن طريق تحفيز IL-10 وقمع استجابات الخلايا التائية الخاصة ب DENV12,13. بالإضافة إلى ذلك ، كان بروتين حمى الضنك NS1 مرتبطا بمرض سريري شديد ، وارتبط تركيز NS1 > 600 نانوغرام مل -1 في الأيام الثلاثة الأولى من المرض بتطور DHF14.
يمكن استخدام استمرار مستضد حمى الضنك NS1 في المرضى الذين يعانون من DHF كعلامة على حمى الضنكالشديدة 6. هناك عدة طرق للكشف عن NS1 في العينات السريرية مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) والاختبار السريع15. المعيار الذهبي لقياس تركيز بروتينات NS1 في بيئة سريرية هو طريقة ELISA. ومع ذلك ، فإن طريقة ELISA باهظة الثمن وتتطلب موظفين مهرة ومرافق مختبرية16. لذلك ، لا يزال تطوير التكنولوجيا للكشف عن بروتينات NS1 وقياسها في اختبار نقطة الرعاية (POCT) مستمرا. في العقد الماضي ، أصبحت المقايسات المناعية الورقية مثل فحوصات التدفق الجانبي (LFAs) والأجهزة التحليلية الورقية الدقيقة (μPADs) شائعة كاختبارات تشخيصية بسبب بساطتها وسرعتها وعدم تكلفتها وخصوصيتها17،18،19. في المقايسة المناعية الورقية ، تم استخدام العديد من الملصقات لتوليد إشارات ، مثل جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) 20 ، والجسيمات النانوية المغناطيسية21,22 ، والنقاط الكمومية23 ، والمواد الفلورية24,25. AuNPs هي الملصقات الأكثر شيوعا المستخدمة في المقايسات المناعية الورقية نظرا لتكلفة إنتاجها غير المكلفة وسهولة التصنيع والاستقرار والقراءات البسيطة. حاليا ، يتم استخدام فحوصات التدفق الجانبي (LFAs) لحمى الضنك NS1 بشكل مشهور في الإعداد السريري26,27. ومع ذلك ، فإن اكتشاف ملصق LFA التقليدي يستخدم عادة العين المجردة ويوفر نتائج نوعية فقط.
في العقد الماضي ، تم استخدام أكثر من 5 مليارات هاتف ذكي على نطاق واسع على مستوى العالم ، وهناك إمكانية لتطوير الكشف المحمول28,29. تتمتع الهواتف الذكية بقدرات متعددة الوظائف مثل المستشعرات المادية المدمجة والمعالجات متعددة النواة والكاميرات الرقمية ومنافذ USB ومنافذ الصوت واللاسلكية وبرامج التطبيقات ، مما يجعلها مناسبة للاستخدام في منصات أجهزة الاستشعار الحيوية المختلفة30. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح التقنيات اللاسلكية بإرسال البيانات بسرعة ويمكن استخدامها للمراقبة في الوقت الفعلي وفي الموقع31. قام Mudanyali et al. بدمج المقايسة المناعية الورقية والهواتف الذكية لتطوير منصة POCT محمولة وخالية من المعدات وسريعة ومنخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام للملاريا والسل وفيروس نقص المناعة البشرية32. أبلغ Ling et al. عن فحص التدفق الجانبي جنبا إلى جنب مع كاميرا الهاتف الذكي للكشف عن نشاط الفوسفاتيز القلوي في الحليب كميا33. طور Hou et al. أيضا نظام تصوير ثنائي الطريقة قائم على الهاتف الذكي للإشارات الكمية من اللون أو التألق في مقايسة التدفق الجانبي34. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي استخدام الهاتف الذكي كقارئ لوني وكمي إلى تحسين الحساسية بينما لا تستطيع العين المجردة الإبلاغ بثقة عن وجود الهدف35.
يقدم DEN-NS1-PAD36،37،38 (المشار إليه باسم الجهاز من الآن فصاعدا) طفرة في تشخيص حمى الضنك ، ويقدم حلا محمولا وفعالا. باستخدام تقنية الموائع الدقيقة القائمة على الورق المطبوعة بالشمع ، يقوم هذا الجهاز بتحديد كمية NS1 بحساسية عالية وخصوصية من خلال معالجة الصور. لتعزيز فائدته بشكل أكبر ، قمنا بتطوير تطبيق هاتف ذكي سهل الاستخدام للقراءة اللونية والكمية. يؤكد التحقق السريري باستخدام عينات المرضى من المستشفيات التايلاندية تأثيره الفوري على تقييم المرضى في الوقت الفعلي. يمثل ابتكارنا تقدما محوريا في الإدارة المبسطة لحمى الضنك في نقاط الرعاية ، مما يعد بإحداث ثورة في التشخيص في مشهد الرعاية الصحية المحدودة الموارد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
منحت لجنة الأخلاقيات التابعة لمجلس المراجعة المؤسسية ، الإدارة الطبية للجيش الملكي التايلاندي ، مستشفى فرامونجكوتكلاو ، بانكوك ، تايلاند (IRBRTA 1218/2562) الموافقة. في إجراء هذه الدراسة ، امتثلنا لجميع اللوائح الأخلاقية اللازمة.
1. تصنيع جهاز المقايسة المناعية الورقية
ملاحظة: تم تصنيع جهاز المقايسة المناعية الورقي باتباع الطرق المحددة مسبقا36،37 ، وطلب براءة الاختراع التايلاندي رقم 19010081638.
- التصميم ورسم الأنماط: صمم الجهاز التحليلي الورقي (الشكل 1 أ ، ب) ب 18 نمطا من شمع PAD على الكمبيوتر.
ملاحظة: التصميم خاص ومخصص للورق بحجم A5. يرتبط عدد PADs بحجم الورق ، كما يطلب المستخدم. - اطبع النمط المصمم على ورق السليلوز باستخدام طابعة الشمع (جدول المواد).
- قم بإذابة الورق المطبوع بالشمع في فرن المختبر لمدة 75 ثانية عند 150 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتخزينه في صندوق السيليكا حتى الحاجة للخطوات اللاحقة.
- ضع 0.5 ميكرولتر من 0.025٪ بولي-إل-ليسين (PLL) على كل من مناطق الاختبار والتحكم. احتضانها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 دقيقة في صندوق السيليكا ثم سخنيها في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- ضع 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام μL-1 من الجسم المضاد IgG المضاد للفأر الماعز على منطقة التحكم و 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام μL-1 من الجسم المضاد للالتقاط على منطقة الاختبار. اترك القطرات تجف في صندوق هلام السيليكا في RT لمدة 30 دقيقة.
- ضع 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب على منطقة العينة ، و 3 ميكرولتر على المنطقة المترافقة ، و 2 ميكرولتر على منطقة الكشف. اترك القطرات تجف في RT في صندوق هلام السيليكا لمدة 30 دقيقة.
- ضع 2 ميكرولتر من محلول مركب الأجسام المضادة للجسيمات النانوية الذهبية (AuNPs-Ab) على المنطقة المترافقة واتركه يجف في صندوق هلام السيليكا في RT لمدة 30 دقيقة.
2. تجميع المقايسة المناعية الورقية
- قم بإزالة الفيلم الواقي بعناية على الجانب الخلفي من بطاقة الدعم البلاستيكية اللاصقة لفضح المادة اللاصقة.
- قم بمحاذاة ورق السليلوز المعالج مع بطاقة الدعم البلاستيكية اللاصقة واضغط بقوة على الطبقتين معا.
ملاحظة: تجنب لمس المجال المحب للماء لتقليل مخاطر التلوث أو تلف الجهاز. - ضع طبقة بلاستيكية لتغطية الورق واضغط عليهما معا.
- قطع قطعة الأجهزة المطلوبة باستخدام مقص من أوراق الأجهزة المجمعة بالكامل.
- DEN-NS1-PADs (الشكل 1C) جاهزة الآن للاستخدام. لتحقيق الاستقرار على المدى الطويل ، قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. إعداد اقتران AuNPs-Ab
ملاحظة: تم إعداد AuNPs-Ab كما هو موضح سابقا من قبل Prabowo et al.36.
- اجمع بين 10 ميكرولتر من 1 ملغ mL−1 anti-NS1 في PBS ، و 1 مل من 40 نانومتر AuNPs الغروية ، و 0.1 مل من 0.1 M بورات عازلة (درجة الحموضة 8.5).
- قم بتدوير الخليط عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة واحتضانه في RT.
- ضع 0.1 مل من 10 مجم مل −1 BSA في BBS ، وقم بالتدوير عند 50 دورة في الدقيقة ، واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي الحل عند 20187 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- ماصة بعناية وفصل طاف من AuNPs-Ab المترسب.
- إعادة تعليق AuNPs-Ab في 500 ميكرولتر من BBS وتفريقه باستخدام صوتنة.
- كرر الطرد المركزي عند 20187 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: كرر عمليات التشتت والطرد المركزي 3x. - أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المترافق إلى التعليق ، مما يجعله جاهزا للتطبيق على المنطقة المرافقة.
4. تطوير تطبيقات الهاتف المحمول
- معالجة الصور وتطوير التعلم الآلي
- اجمع مجموعة بيانات لنموذج صورة خاضع للإشراف من خلال جمع أكثر من 900 صورة ذات تركيز تلقائي ل DEN-NS1-PADs ، والتقاط ظروف مختلفة مثل التركيزات المختلفة والعلامات التجارية للكاميرات (12-13 ميجابكسل) والتدوير (90 درجة و 180 درجة) وإعدادات الإضاءة. استهدف 30 صورة تحت كل ظرف محدد.
- قم بتسمية الحقيقة الأساسية من خلال تحديد منطقتين مهمتين والتعليق عليهما كمناطق اختبار وتحكم داخل الصور التي تم جمعها للتعلم الخاضع للإشراف.
- تصميم خوارزمية لتحديد شريط الخلفية. حدد موقع خط الوسط بين منطقتي الاختبار والتحكم ، واحسب نقطة المنتصف ، وقم بإنشاء منطقة مربعة تتناسب مع متوسط حجم المنطقتين الرئيسيتين مع الحفاظ على نفس اتجاه الدوران.
- قم بإنشاء نموذج تجزئة الصورة باستخدام مجموعة البيانات وتسميات الحقيقة الأساسية من الخطوتين 4.1.1 و 4.1.2 لتدريب نموذج تجزئة الصورة لتحديد مناطق الاهتمام.
- خوارزمية التطبيق
- قم بتطبيق نموذج تجزئة الصورة المدرب على الصور الجديدة لتحديد موقع مناطق الاختبار والتحكم والخلفية تلقائيا.
- استخدم تقنيات معالجة الصور الأساسية للحصول على قيمة كثافة واحدة لكل منطقة من مناطق الاهتمام الثلاث (الاختبار والتحكم والخلفية).
- تحويل الصورة إلى تمثيل صفيف 3D (y ، x قناة) للوصول إلى قيم البكسل.
- قم بتحويل الصورة إلى درجات رمادية عن طريق حساب متوسط قيم RGB وتطبيق الانعكاس بالصيغة (255-x).
- تطبيع قيم منطقة الاختبار والتحكم عن طريق طرح قيمة منطقة الخلفية.
- استخدم منحنى المعايرة المحدد مسبقا لحساب تركيز NS1.
- صنف النتائج على أنها موجبة أو سالبة بناء على قيمة فاصلة تبلغ 0.1103 مشتقة من شدة التدرج الرمادي الطبيعية37.
5. منحنى المعايرة والحساسيات
- تحضير عينة NS1 في مصل الدم البشري للمعايرة بتركيزات 0 و 0.1 و 0.2 و 0.4 و 0.6 و 0.8 و 1.0 ميكروغرام mL-1.
- أسقط 50 ميكرولتر من كل تركيز على منطقة العينة وقم بإجراء القياسات في ثلاث نسخ.
- اترك العينات تتسرب تماما في الجهاز ، الأمر الذي قد يستغرق 20-30 دقيقة للحصول على النتائج.
- التقط صورا للجهاز باستخدام كاميرا رقمية أو هاتف ذكي بعد 5 دقائق من الحضانة.
- تحليل مناطق الاختبار والتحكم باستخدام ImageJ وتطبيق جوال مخصص.
- أنشئ منحنى المعايرة استنادا إلى البيانات من ImageJ وتطبيق الهاتف المحمول.
- احسب حد الفراغ (LOB) وحد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOQ) باستخدام المعادلات (1-3) أدناه:
LOB = متوسط البيانات الفارغة + 1: 645 * ð (الانحراف المعياري للبيانات الفارغة) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (الانحراف المعياري لبيانات التركيز الأدنى) (2)
LOQ = متوسط البيانات الفارغة + 10 * ð (الانحراف المعياري للبيانات الفارغة) (3)
6. إجراء مقايسة مناعية ورقية مع عينات سريرية
- جمع ومعالجة 300 ميكرولتر من الدم المحيطي من 30 مريضا في اليوم الأول من دخول المستشفى إلى أنابيب EDTA ذات قمة أرجوانية ، باتباع الممارسات السريرية الجيدة.
- جهاز طرد مركزي للدم عند 2884 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
- انقل المكون السائل (البلازما) إلى أنبوب بولي بروبيلين نظيف باستخدام ماصة.
- قم بتخزين البلازما في الفريزر على الفور عند -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.
- ضع 20 ميكرولتر من البلازما على منطقة العينة أعلى الجهاز. ثم أضف 30 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.05٪ v / v توين 20 في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
- اترك العينة تدخل تماما في الجهاز ، الأمر الذي قد يستغرق 20-30 دقيقة للحصول على النتائج.
- التقط صورا للجهاز باستخدام كاميرا رقمية أو هاتف ذكي بعد 5 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
- تحليل مناطق الاختبار والتحكم باستخدام ImageJ وتطبيق جوال مخصص.
7. القياس الكمي باستخدام تطبيقات الهاتف المحمول
ملاحظة: يتم تحليل شدة المقايسة المناعية الورقية في تطبيق الهاتف المحمول (الشكل 2).
- افتح تطبيق الهاتف المحمول المطور على الهاتف الذكي.
- حدد استخدام الكاميرا أو تحميل من المعرض لاختيار مصدر البيانات أو تحميله. قم بذلك من خلال التقاط الكاميرا أو عن طريق تحديد صورة من معرض الجهاز.
- انتقل إلى القسم التحليلي والمس الزر تحليل على الشاشة.
- انتظر حتى يقوم التطبيق بتحليل البيانات وعرض النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعد اختيار طريقة التصنيع أمرا محوريا لضمان أداء الفحص القابل للتكرار في أجهزة المقايسة المناعية الورقية. في دراستنا ، استكشفنا عمليات ومواد التصنيع المختلفة في سياق إظهار المقايسة المناعية الورقية. تستخدم الطريقة التي اخترناها نظام طباعة الشمع لإنشاء حواجز كارهة للماء داخل أجهزة الموائع الدقيقة الورقية. يبرز هذا النهج بسبب بساطته وسرعته ونتائجه المتسقة. وتجدر الإشارة إلى أنه يوفر ميزة تجنب استخدام المواد الكيميائية المقاومة للضوء ، والتي لديها القدرة على التدخل في امتصاص البروتين وزيادة مقاومة ورق السليلوز للماء. علاوة على ذلك ، تضمن الطباعة بالشمع أبعادا متسقة للقنوات السائلة ، مما يساهم في أداء الفحص القابل للتكرار.
بعد تشكيل حواجز كارهة للماء ، تم تطبيق الكواشف اللازمة للمقايسة المناعية على سطح ورق السليلوز. مع الامتزاز الكهروستاتيكي ، ساعد PLL في تجميد الجزيئات الحيوية من خلال التفاعل مع كل من الشحنة الموجبة للمجموعات الوظيفية للأمين والجسم المضاد سالب الشحنة. تسهل هذه الخطوة تعديل الأجسام المضادة وتجميدها وتطبيق اتحادات الأجسام المضادة للتسمية أثناء عمليات التصنيع. الأهم من ذلك ، يمكن إجراء هذه الخطوة بالتوازي. يتم الانتهاء من تجميع أجهزة المقايسة المناعية الورقية (DEN-NS1-PAD ، كما هو موضح في الشكل 1A) عن طريق تكديس الورق المعدل على بطاقة دعم بلاستيكية لاصقة وتصفيحها بغشاء بلاستيكي.
الغرض الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة سهلة الاستخدام باستخدام هاتف ذكي لقياس تركيزات NS1. يمكن استخدام هذا النهج كجهاز اختبار نقطة الرعاية (POCT) في كل من الإعدادات المنزلية والسريرية. بالنظر إلى النطاق الواسع لتركيزات NS1 في مصل المريض ، تم استخدام نماذج خطية بسيطة بناء على نتائج هذه التجارب. لكل تركيز NS1 ، تم إعداد مجموعة بيانات تضم ثلاثة أجهزة اختبار. تم التقاط صور للأجهزة باستخدام هاتف ذكي في ظل الإعدادات القياسية وظروف الإضاءة المثلى ، مما يلغي الحاجة إلى صندوق مظلم. تحتوي منطقة اختبار PADs على جسم مضاد أحادي النسيلة لحمى الضنك NS1 للفأر ، بينما تتميز منطقة التحكم بجسم مضاد IgG مضاد للماعز. مع تنسيق فحص شطيرة ، تتوافق تركيزات NS1 الأعلى في العينات مع زيادة كثافة اللون الأحمر في منطقة الاختبار. في المقابل ، تظل كثافة اللون في منطقة التحكم ثابتة نسبيا. يعرض الشكل 1B صور الهواتف الذكية غير المعالجة ، والتي توفر مراقبة بصرية مفيدة دون الحاجة إلى معدات متخصصة.
باستخدام تطبيق مخصص للهاتف المحمول ، قمنا بتطبيع الشدة وحساب النماذج الخطية البسيطة لتركيزات NS1 المسننة في عينات المصل - ارتباط المعامل (r2) الذي تم الحصول عليه من تطبيق الهاتف المحمول. كان ارتباط المعامل (r2) الذي تم الحصول عليه من تطبيق الهاتف المحمول 0.92 (الشكل 3) ، بما يتماشى مع التوقعات. تفوق هذا النهج القائم على الهواتف الذكية على المراقبة بالعين المجردة ، مما عزز الحساسية بشكل كبير بنسبة 178٪. بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب حد الفراغ (LoB) وحد الكشف (LoD) وحد القياس الكمي (LoQ) للشدة الطبيعية ، كما هو موضح في الجدول 1.
تم استخدام عينات سريرية في العالم الحقيقي لإثبات الوظائف العملية ل DEN-NS1-PADs في الإعدادات السريرية. أنتجت المقايسة المناعية الورقية قراءات لونية نوعية في غضون 20-30 دقيقة ، مما يسمح بالتحديد البصري للنتائج السلبية أو الإيجابية. تم إخضاع عينات المصل من المرضى المشتبه في إصابتهم بحمى الضنك للجهاز. يوضح الشكل 4 ويقارن النتائج التي تم الحصول عليها من كل من الجهاز واختبار التشخيص السريع التجاري (RDT). يلخص الجدول 2 نتائج القراءات البصرية والنظام القائم على الهواتف الذكية. أسفر RDT التجاري والجهاز عن نتائج مماثلة ، مع سبع نتائج إيجابية و 23 نتيجة سلبية من القراءة البصرية. في المقابل ، أبلغ نظام القارئ المستند إلى الهاتف الذكي المطبق حصريا على الجهاز عن تسع نتائج إيجابية و 21 نتيجة سلبية من العينات السريرية.
الشكل 1: صور DEN-NS1-PAD المصممة والمصنعة. (أ ، ب) تم تصميم قناة واحدة من الحاجز الكارهة للماء المنقوش بالشمع وتصويرها في ثلاث حالات (C) قبل و (D ، E) بعد إدخال محلول العينة إلى المنطقة المحددة وإظهار النتائج السلبية (D) و (E) الإيجابية ، على التوالي. يتدفق محلول العينة عبر القناة (انظر السهم المسمى) ، ويتفاعل مع المكونات في المواقع الرئيسية - AuNPs-Ab في المنطقة المترافقة ، والجسم المضاد ل NS1 في منطقة الاختبار (مما يدل على نتيجة إيجابية لحمى الضنك NS1) ، ومضاد IgG المضاد للفأر في منطقة التحكم. يمكن ملاحظة النتائج بسهولة بالعين المجردة ويمكن قياسها عن طريق معالجة الصور باستخدام ماسح ضوئي مسطح أو كاميرا هاتف ذكي. اختصار: AuNPs-Ab = اقتران الجسيمات النانوية الذهبية والأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لقطات شاشة لشاشة الهاتف من تطبيق الهاتف المحمول. (أ) شاشة المستخدم لتطبيق Android الذي يعمل على جهاز الهاتف المحمول ، (ب) عرض شاشة التطبيق ، (ج) القائمة الرئيسية للتطبيق التي يمكن للمستخدمين تحديدها لاستخدام الكاميرا أو تحميل صورة من المعرض ، (د) عرض صورة ذات صلة للاختبار ، (ه) عرض وقت العد التنازلي للتحليل ، (و) عرض نتائج الاختبار ، بما في ذلك شدة الاختبار ومنطقة التحكم ، وقرار العدوى (إيجابي / سلبي) ، وتركيز NS1 في العينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنى المعايرة الخطية للكشف عن NS1 في المصل. تم استخدام الجهاز وتفسير الصور عن طريق المعالجة عبر تطبيق يعتمد على بيانات الهاتف الذكي. تظهر أشرطة الخطأ ±1 الانحراف المعياري ، n = 3. الاختصارات: T = منطقة الاختبار ؛ C = منطقة التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة DEN-NS1-PAD من فحص العينة السريرية. تم استخدام المصل (50 ميكرولتر) في المقايسة المناعية الورقية. (أ) مثال على النتيجة السلبية ، (ب) النتائج الإيجابية ، (ج) النتائج الإجمالية ومقارنة RDT مقابل المقايسة المناعية الورقية. الاختصارات: RDT = اختبار التشخيص السريع. نقاط البيع = إيجابية ؛ Neg = سلبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البارامتر | العين المجردة | تطبيق الموبايل |
| حد الفراغ (LoB) | - | 43.15 نانوغرام مل -1 |
| حد الكشف (LoD) | 200 نانوغرام مل -1 | 112.19 نانوغرام مل -1 |
| حد القياس الكمي (LoQ) | - | 373.58 نانوغرام مل -1 |
الجدول 1: LoB و LoD و LoQ من ImageJ وتطبيق الهاتف المحمول على معيار معايرة البيانات NS1 في المصل. الاختصارات: LoB = حد الفراغ ؛ LoD = حد الكشف ؛ LoQ = حد القياس الكمي.
| رقم المريض | العين المجردة | تطبيق الهاتف الذكي | إيماج جي | |
| آر دي تي | المقايسة المناعية الورقية | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
الجدول 2: مقارنة بين القراءة المرئية ونتائج نظام القارئ القائم على الهاتف الذكي لعينات المصل. (+) و (-) تشير إلى التفسيرات الإيجابية والسلبية للنتائج ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتمثل إحدى معلمات التصميم المهمة لنظام القارئ المستند إلى الهاتف الذكي في القدرة على توفير معالجة تصوير قابلة للتكرار للعينات. في هذه الدراسة ، من أجل البساطة والراحة ، تم التقاط الصور من ثلاث علامات تجارية مختلفة للهواتف الذكية بكاميرات 12-13 ميجابكسل دون استخدام صندوق تصوير أو ملحقات. يمكن أن تؤثر الظروف المتغيرة لالتقاط الصور ، مثل دقة الكاميرا ووقت التقاط الصور وظروف الإضاءة والبيئة ، على كثافة لون الاختبار والتحكم في النقاط على الجهاز. تم تقليل تأثير أوقات التقاط الصور المختلفة على إضاءة وتجفيف PAD على شدة إشارة الأجهزة باستخدام شدة الإشارة العادية ، والتي ظلت متسقة عبر الصور الملتقطة في أوقات مختلفة36. ظهر طرح إشارة الخلفية كاستراتيجية لتعزيز دقة قياسات كثافة اللون ، مما يخفف بشكل فعال من تأثير ظروف الإضاءة. تتوافق النتائج التي توصلنا إليها مع الأبحاث السابقة التي تسلط الضوء على فعالية تقنيات الطرح الأساسية أو الخلفية في تقليل الآثار البيئية39,40.
الجدل الدائر حول تفوق استخدام صندوق التصوير أو طريقة خالية من الملحقات له آثار على معالجة الصور39,41. يمكن لصندوق التصوير تعزيز متانة نتائج معالجة التصوير عن طريق تقليل الاختلافات في ظروف التصوير41،42،43. في هذه الدراسة ، استخدمنا تطبيقا للهاتف المحمول يعتمد على التعلم الآلي السحابي لمعالجة الصور. يستفيد هذا النهج من التعلم الآلي داخل نظام أساسي قائم على السحابة لتصنيف بيانات الصور واستخراجها وإثرائها تلقائيا. حدد التطبيق بشكل فعال وعالج منطقة الاهتمام داخل الصور ، بما في ذلك مناطق الخلفية والاختبار والتحكم. كانت هذه الخطوة محورية في التمييز بين هذه المناطق38. تشير الأبحاث السابقة إلى أن معالجة الصور التي تتضمن التعلم الآلي تنتج تصنيفا فائقا بين نتائج عينات التحكم والاختبار43،44،45. في هذه الدراسة ، أدى استخدام الموقع الثابت وطرح الخلفية إلى إنشاء إشارة خلفية متسقة من السليلوز μPADs ، مما يعزز اتساق ودقة تصنيف القراءات التي يوفرها تطبيق الهاتف المحمول40,43.
فيما يتعلق بالأداء المتسق في إظهار المقايسة المناعية الورقية ، تلعب طريقة التصنيع دورا مهما. في دراسة سابقة36 ، تمت دراسة العديد من شروط التحسين لطريقة تصميم وتصنيع DEN-NS1-PAD ، مثل تركيزات PLL ، والمواد المانعة ، والجسم المضاد NS1. اختبر الجهاز بنجاح NS1 في المخزن المؤقت ، وزراعة الخلايا ، والمصل البشري نوعيا وكميا.
يمكن أن تتداخل تأثيرات المصفوفة الناتجة عن مكونات المصل مع حد اكتشاف الجهاز عند اختبار عينات المصل. ومع ذلك ، تشير النتائج إلى أن المقايسة المناعية المطورة يمكن أن تكتشف بنجاح تركيزات NS1 في عينات المصل ، مما ينتج عنه نتائج مماثلة لتلك الخاصة ب RDT التجاري (الجدول 2). لوحظت النتائج الظاهرة باستخدام الفحص البصري وتطبيق الهاتف المحمول (الشكل 4) ، مما يؤكد فعالية الفحص لاختبار المصل. في حين أن اللزوجة العالية للمصل قد تؤثر على أوقات التحليل ، إلا أنها لا تعيق تفسير النتيجة36. يمكن أن يوفر استخدام تطبيق الهاتف المحمول نتائج أكثر إيجابية لفحوصات العينات لأن استخدام تطبيق الهاتف المحمول يحسن بشكل كبير من حساسية اختبار العينة46. تجدر الإشارة إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من المقارنات مع المقايسات الجزيئية مثل RT-PCR15،47،48 لحمى الضنك NS1 لتحديد النتائج الإيجابية الكاذبة أو السلبية الكاذبة المحتملة.
ينشأ قيد ملحوظ لهذه الدراسة عند النظر في مصفوفة عينة أكثر تعقيدا مثل الدم. يمكن أن تتداخل المكونات الموجودة في الدم بالفعل مع حد الكشف عن الجهاز. في مثل هذه الحالات ، يمثل استخدام وسادات ماصة إضافية لتعزيز امتصاص المخزن المؤقت للتشغيل حلا محتملا. يمكن أن يساعد هذا التعديل في تخثر الدم ، والاستفادة من خصائص السليلوز الدموية من خلال التأثير على الصفائح الدموية49. هناك طريقة أخرى تتضمن تطبيق قطرات محلول ملحي بنسبة 4٪ (وزن / حجم) على وسادة العينة لتعزيز تخثر الدم. أظهرت الأبحاث السابقة أن الأملاح مثل كلوريد الكالسيوم وكلوريد الصوديوم تحفز تخثر خلايا الدم الحمراء (RBC)50,51. يمكن ل Na + زعزعة استقرار تعليق كرات الدم الحمراء في الدم عن طريق قمع الطبقة الكهربائية المزدوجة على سطح كرات الدم الحمراء وتقليل تنافر الشحنة بين كرات الدم الحمراء. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي التركيز العالي للملح أيضا إلى تراكم الدم52. علاوة على ذلك ، فإن شحنة تكافؤ الأيونات المضادة ل Na + تمنع سمك الطبقة المزدوجة المشحونة من كرات الدم الحمراء ، مما يؤدي إلى تجميع كرات الدم الحمراء المفرغة. تسهل إضافة محلول ملحي بنسبة 4٪ (وزن / حجم) (NaCl) فصل البلازما على ورق السليلوز51. ومع ذلك ، فإن التحسين الدقيق لتركيز المحلول الملحي ضروري لتجنب إحداث تأثيرات غير مرغوب فيها على تراكم الدم وتراكم جسيمات الذهبالنانوية 53,54.
قدمت طابعات الشمع التجارية مزيجا مثاليا من التكلفة وبساطة النماذج الأولية. نظرا لتوقف هذه الطابعات في عام 2016 ، كانت هناك حاجة إلى طرق تصنيع بديلة مثل الطباعة النافثة للحبر55 وطباعة الشاشة56 والطباعة الحجريةالضوئية 57. تعد طابعة الحبر المكتبية مرشحا جيدا لتصنيع μPAD. يخلق راتنج البوليستر الموجود في مسحوق الحبر أنماطا كارهة للماء عند 200 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بتصميمات مختلفة58.
تم استخدام الجسم المضاد NS1 serotype two ، كما هو محدد من قبل الشركة ، في هذا البحث. ومع ذلك ، وجدنا أن هذا الجسم المضاد يتفاعل أيضا مع جميع الأنماط المصلية36,37. وتكون حساسيات الكشف عن فيروس حمى الضنك-4 أقل (87.5٪) مقارنة بالأنماط المصلية الأخرى. تبلغ حساسية DENV-1 و DENV-2 حوالي 88.89٪ ، وبالنسبة ل DENV-3 هي 100٪ 37. تتوافق هذه النتائج مع الأبحاث السابقة ، والتي أبلغت أيضا عن حساسية أقل ل RDT ل DENV-4 مقارنة بالأنماط المصلية الأخرى59. الحساسية الكلية للجهاز هي ~ 88.89٪ ، مع خصوصية تبلغ حوالي 86.67٪. من الجدير بالذكر أن الحساسية الفعلية ل DEN-NS1-PAD قد تتجاوز حساسية RDT التجارية. ومع ذلك ، يوضح RDT قيمة تنبؤية إيجابية (PPV) تبلغ 84.62٪ ودقة 87.67٪. والجدير بالذكر أن أداء DEN-NS1-PAD كان أفضل في الكشف عن عدوى حمى الضنك في أول 5-6 أيام ، في حين أن RDT فعال فقط في الأيام الخمسة الأولى37.
باختصار ، فإن الجمع بين المقايسة المناعية الورقية المحمولة (DEN-NS1-PAD) مع تطبيق الهاتف الذكي يحمل وعدا كبيرا لقياس حمى الضنك NS1. يعزز تطبيق الهاتف المحمول بشكل كبير الحساسية والكفاءة في قياس NS1 في عينات المصل مقارنة بالملاحظة بالعين المجردة. تشمل مزايا تطبيق الهاتف المحمول تقليل وقت التحليل وسهولة الاستخدام والتوافق مع أجهزة الهواتف الذكية المتنوعة والمواقف وظروف الإضاءة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لتحسين الحساسية والأداء. وفي الوقت نفسه ، يعد تعديل المقايسة المناعية الورقية ضروريا لتحسين أدائها عند التعامل مع عينات الدم. وعلاوة على ذلك، يلزم إجراء تقييمات شاملة ل DEN-NS1-PAD للكشف عن حمى الضنك باستخدام عدد أكبر من الأنماط المصلية الأولية للعدوى وعينات مختارة تم جمعها من مختلف المرضى (الأطفال والبالغين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يعترف MHP بامتنان بصندوق أبحاث المنح الدراسية من Universitas Islam Indonesia (UII). يعرب المؤلفون عن امتنانهم للسيد نوتشانون نينياوي لخبرته القيمة ومساعدته طوال تطوير تطبيق الهاتف المحمول ومساهماته في المخطوطة. علاوة على ذلك ، يقدر المؤلفون الدعم المالي المقدم من تايلاند للبحث العلمي والابتكار (TSRI) ، صندوق البحوث الأساسية: السنة المالية 2023 (المشروع رقم. FRB660073/0164) في إطار برنامج الرعاية الصحية الذكية لجامعة الملك مونغكوت للتكنولوجيا في ثونبوري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
