الكشف عن النمط الظاهري الحديدي للورم الأرومي النخاعي
Summary
يمثل محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون المؤشر الأكثر استخداما لموت الخلايا الحديدية. توضح هذه المقالة تحليل قياس التدفق الخلوي خطوة بخطوة لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في الخلايا عند تحريض الفيروسات.
Abstract
تفاعل الحديد والأكسجين هو جزء لا يتجزأ من تطور الحياة على الأرض. ومع ذلك ، لا تزال هذه الكيمياء الفريدة تبهر وتحير ، مما يؤدي إلى مشاريع بيولوجية جديدة. في عام 2012 ، أدركت مجموعة من جامعة كولومبيا هذا التفاعل كحدث مركزي يؤدي إلى نوع جديد من موت الخلايا المنظم يسمى “ferroptosis”. السمة الرئيسية لداء الحديديات هي تراكم هيدروبيروكسيدات الدهون بسبب (1) الدفاع المضاد للأكسدة المختل وظيفيا و / أو (2) الإجهاد التأكسدي الساحق ، والذي يتزامن في أغلب الأحيان مع زيادة محتوى الحديد الحر في الخلية. يتم منع ذلك عادة عن طريق المحور الكنسي المضاد للحديد الذي يضم ناقل السيستين xCT والجلوتاثيون (GSH) و GSH peroxidase 4 (GPx4). نظرا لأن داء الحديد ليس نوعا مبرمجا من موت الخلايا ، فإنه لا يتضمن مسارات إشارات مميزة لموت الخلايا المبرمج. الطريقة الأكثر شيوعا لإثبات هذا النوع من موت الخلايا هي استخدام مضادات الأكسدة المحبة للدهون (فيتامين E ، ferrostatin-1 ، إلخ) لمنعه. يمكن لهذه الجزيئات الاقتراب من الضرر التأكسدي وإزالة السموم منه في غشاء البلازما. جانب آخر مهم في الكشف عن النمط الظاهري الحديدي هو الكشف عن التراكم السابق لهيدروبيروكسيدات الدهون ، والتي تستخدم لها صبغة محددة BODIPY C11. ستوضح المخطوطة الحالية كيف يمكن إحداث داء الحديد في خلايا الورم الأرومي النخاعي من النوع البري باستخدام محفزات مختلفة: erastin و RSL3 والمتبرع بالحديد. وبالمثل ، سيتم استخدام خلايا xCT-KO التي تنمو في وجود NAC ، والتي تخضع لداء الحديد بمجرد إزالة NAC. يظهر النمط الظاهري “الفقاعي” المميز تحت المجهر الضوئي في غضون 12-16 ساعة من لحظة حدوث داء الحديديات. علاوة على ذلك ، سيتم استخدام تلطيخ BODIPY C11 متبوعا بتحليل FACS لإظهار تراكم هيدروبيروكسيدات الدهون وما يترتب على ذلك من موت الخلايا باستخدام طريقة تلطيخ PI. لإثبات الطبيعة الحديدية لموت الخلايا ، سيتم استخدام ferrostatin-1 كعامل محدد لمنع الإصابة بالفيروسات.
Introduction
Ferroptosis هو نوع من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تعتمد على السياق حديثا من موت الخلايا1. إلى جانب أنواع الأكسجين التفاعلية ، يلعب الحديد دورا (أدوارا) حاسما في هذا النوع من موت الخلايا ، ومن هنا جاء الاسم2. الخطوة الأخيرة والتنفيذية لداء الحديديات هي التراكم المحفز بالحديد للضرر التأكسدي للدهون في غشاء البلازما الذي يؤدي في النهاية إلى ضعف سلامة الغشاء والنفاذية الانتقائية ، وأخيرا موت الخلايا عن طريق الفقاعات. حدث هيدروبيروكسيد الدهون هو ظاهرة تحدث بشكل طبيعي. ومع ذلك ، يتم منع انتشاره في جميع أنحاء الغشاء الخلوي عن طريق الدفاع المضاد للأكسدة للخلية. اللاعب الرئيسي في هذا السياق هو Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4) ، والذي يمكنه الاقتراب من الغشاء وتحويل هيدروبيروكسيدات الدهون إلى مشتقات الكحول الأقل سمية3. يتم توفير الطاقة المختزلة ل GPx4 بشكل أساسي ، ولكن ليس حصريا ، بواسطة الجلوتاثيون (GSH) ، وهو ثلاثي الببتيد يتكون من الأحماض الأمينية غير الأساسية: الجلايسين والغلوتامات والسيستين. الأحماض الأمينية التي تحد من معدل التخليق الحيوي ل GSH هي السيستين4. على الرغم من تصنيف السيستين على أنه حمض أميني غير أساسي ، إلا أن متطلباته يمكن أن تتجاوز بسهولة إنتاجه الداخلي في الخلايا التكاثرية للغاية (مثل الخلايا السرطانية). وبالتالي تم إعادة تصنيفها في مجموعة الأحماض الأمينية شبه الأساسية. يحدث الاستيراد الضروري للسيستين بشكل رئيسي من خلال نظام Xc ، والذي يسمح باستيراد الشكل المؤكسد (المهيمن) من السيستين (المعروف أيضا باسم السيستين) على حساب تصدير الغلوتامات5. يتكون نظام Xc من وحدة نقل فرعية مستقلة Na + ، تعتمد على Cl ، تعرف باسم xCT ، ووحدة فرعية مرافقة ، تعرف باسم CD98. حتى وقت قريب ، كان ينظر إلى الخصائص المضادة للحديد لمحور xCT-GSH-GPx4 على أنها فريدة وغير قابلة للتكرار6. ومع ذلك ، في عام 2019 ، تم وصف مسار بديل مضاد للحديد ، يتكون من يوبيكوينول (الإنزيم المساعد Q10) وإنزيمه التجديدي – بروتين مثبط الحديدي 1 (FSP1) ، 7,8. بعد ذلك بوقت قصير ، تم الإبلاغ عن نظام آخر لإزالة السموم من هيدرو بيروكسيد الدهون يتضمن GTP cyclohydrolase-1 / tetrahydrobiopterin (GCH1 / BH4)9. ومع ذلك ، يبدو أن الدور المركزي لمحور xCT-GSH-GPx4 في الوقاية من داء الحديديات لا يتم تحديه.
على مدى العقد الماضي ، تمت دراسة داء الحديديات على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من أنواع الأورام ، مما أظهر إمكانات كبيرة كاستراتيجية مضادة للسرطان (تمت مراجعته بواسطة Lei et al.10). علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا السرطانية التي تظهر مقاومة عالية للعلاج الكيميائي التقليدي و / أو الميل إلى الانتقال حساسة بشكل مدهش لمحفزات داء الحديد ، مثل مثبطات GPx411،12،13. ومع ذلك ، في سياق أورام المخ ، لا تزال إمكانات المحرضات الحديدية غير مدروسة إلى حد كبير. في حين أن هذا النوع من موت الخلايا قد ارتبط ارتباطا وثيقا بإصابة نقص التروية الدماغية14والأمراض التنكسية العصبية15 ، فإن إمكاناته في سياق أورام المخ اقتصرت بشكل أساسي على الورم الأرومي الدبقي ، وهو الورم القحفي الدماغي الخبيث الأكثر شيوعا (تمت مراجعته بواسطة Zhuo et al.16). من ناحية أخرى ، لا تزال حساسية الورم الأرومي النخاعي ، وهو ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا لدى الأطفال والسبب الرئيسي لوفيات الأطفال ، لمحفزات داء الحديد غير مستكشفة إلى حد كبير. على حد علمنا ، هناك أدبيات نادرة تمت مراجعتها من قبل الأقران تربط بين داء الحديديات والورم الأرومي النخاعي. ومع ذلك ، فقد كشفت بعض الدراسات أن الحديد يلعب دورا حاسما في البقاء على قيد الحياة والانتشار والإمكانات السرطانية لكل من الخلايا الجذعية لسرطان الورم الأرومي النخاعي والورم الأرومي الدبقي (CSCs)17,18 ، مما قد يجعلها أكثر عرضة لتحريض داء الحديديات. هذا مهم بشكل خاص لأن الورم الأرومي النخاعي يشتهر بسكانه الفرعيين من الخلايا الجذعية السرطانية ، أو الخلايا البادئة / المنتشرة للورم ، والتي يبدو أنها مسؤولة إلى حد كبير عن المقاومة الكيميائية للورم وانتشاره وانتكاسه19.
عادة ما يتم فحص الحساسية لتحريض داء الحديديات عن طريق قياس محتوى / تراكم هيدرو بيروكسيد الدهون ، والذي قد يؤدي أو لا يؤدي إلى موت الخلايا. محرضات داء الحديد الأكثر استخداما هي (1) ممحاة ، مثبط لناقل xCT20 ، (2) RSL3 ، مثبط لإنزيم GPx42 ، و / أو (3) مانحون للحديد ، مثل سترات الأمونيوم الحديدية (FAC) 21. يتم تقييم محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون باستخدام المسبار الانتقائي BODIPY 581/591 C1122 ، والذي يحتوي على أقصى إثارة وانبعاث عند 581/591 نانومتر في حالته المنخفضة. عند التفاعل مع هيدروبيروكسيدات الدهون وأكسدتها ، يحول المسبار الحد الأقصى للإثارة والانبعاث إلى 488/510 نانومتر. عادة ، تسبق الزيادة الكبيرة في محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون موت الخلايا الحديدية. نظرا لأن داء الحديديات ليس موتا مبرمجا للخلايا ، فلا يوجد سلسلة إشارات جزيئية تؤدي إلى تنفيذه. لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة لتأكيد ذلك هي مراقبة محتوى هيدروبيروكسيد الدهون واستخدام مثبطات محددة لهذا النوع من موت الخلايا ، مثل ferrostatin 123. Ferrostatin 1 هو أحد مضادات الأكسدة المحبة للدهون التي يمكن أن تخترق حجرة الدهون في الخلية وتزيل السموم من هيدروبيروكسيدات الدهون ، وبالتالي تمنع الأحداث الحديدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
السمة المميزة الأساسية لموت الخلايا الحديدية هي التراكم غير المنضبط لهيدروبيروكسيدات الدهون في غشاء البلازما. قد يحدث هذا الضرر التأكسدي بطريقة إنزيمية أو غير إنزيمية ، ولكن في كلتا الحالتين ، يكون التفاعل معتمدا على الحديد / محفزا ، وهو ما يفسر اسم هذا النوع من موت الخلايا. غالبا ما يتم ت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل حكومة إمارة موناكو ، وكذلك من قبل “Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte لمكافحة السرطان” (GEMLUC) ومؤسسة Flavien ، التي وفرت وسائل شراء BD FACS Melody.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
References
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
- Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
- Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
- Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
- Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
- Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
- Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
- Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
- Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
- Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
- Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
- Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
- Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
- Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
- Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
- Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
- Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
- Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
- Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
- Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
- Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
- Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
- Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
- Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
- Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
- Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin’s cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
- Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
- Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
- Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
- Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).
.