Révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome
Summary
La teneur en hydroperoxyde lipidique représente l’indicateur le plus couramment utilisé de la mort cellulaire ferroptotique. Cet article présente l’analyse par cytométrie en flux étape par étape de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules lors de l’induction de la ferroptose.
Abstract
L’interaction du fer et de l’oxygène fait partie intégrante du développement de la vie sur Terre. Néanmoins, cette chimie unique continue de fasciner et d’intriguer, conduisant à de nouvelles entreprises biologiques. En 2012, un groupe de l’Université Columbia a reconnu que cette interaction était un événement central menant à un nouveau type de mort cellulaire régulée appelée « ferroptose ». La principale caractéristique de la ferroptose est l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques due à (1) une défense antioxydante dysfonctionnelle et/ou (2) un stress oxydatif écrasant, qui coïncide le plus souvent avec une teneur accrue en fer labile libre dans la cellule. Ceci est normalement empêché par l’axe canonique anti-ferroptotique comprenant le transporteur de cystine xCT, le glutathion (GSH) et la GSH peroxydase 4 (GPx4). La ferroptose n’étant pas un type programmé de mort cellulaire, elle n’implique pas de voies de signalisation caractéristiques de l’apoptose. La façon la plus courante de prouver ce type de mort cellulaire est d’utiliser des antioxydants lipophiles (vitamine E, ferrostatine-1, etc.) pour la prévenir. Ces molécules peuvent approcher et détoxifier les dommages oxydatifs dans la membrane plasmique. Un autre aspect important dans la mise en évidence du phénotype ferroptotique est la détection de l’accumulation préalable d’hydroperoxydes lipidiques, pour lesquels le colorant spécifique BODIPY C11 est utilisé. Le présent manuscrit montrera comment la ferroptose peut être induite dans les cellules de médulloblastome de type sauvage en utilisant différents inducteurs : l’ératine, la RSL3 et le donneur de fer. De même, les cellules xCT-KO qui se développent en présence de NAC et qui subissent une ferroptose une fois que la NAC est retirée seront utilisées. Le phénotype caractéristique « bouillonnant » est visible au microscope optique dans les 12 à 16 heures suivant le déclenchement de la ferroptose. De plus, une coloration BODIPY C11 suivie d’une analyse FACS pour montrer l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques et la mort cellulaire subséquente à l’aide de la méthode de coloration PI sera utilisée. Pour prouver la nature ferroptotique de la mort cellulaire, la ferrostatine-1 sera utilisée comme agent spécifique de prévention de la ferroptose.
Introduction
La ferroptose est un typede mort cellulaire 1 dépendant des espèces réactives de l’oxygène (ROS) nouvellement contextualisé. Outre les ROS, le fer joue un rôle crucial dans ce type de mort cellulaire, d’où le nom2. L’étape finale et exécutive de la ferroptose est l’accumulation catalysée par le fer de dommages oxydatifs des lipides dans la membrane plasmique qui conduit finalement à une compromission de l’intégrité de la membrane et à une perméabilité sélective, et, enfin, à la mort cellulaire par bouillonnement. L’hydroperoxydation des lipides est un phénomène naturel ; Cependant, sa propagation dans toute la membrane cellulaire est empêchée par la défense antioxydante de la cellule. L’acteur majeur dans ce contexte est la protéine Sè glutathion peroxydase 4 (GPx4), qui peut s’approcher de la membrane et convertir les hydroperoxydes lipidiques en leurs dérivés alcooliques moins toxiques3. Le pouvoir réducteur de GPx4 est principalement, mais pas exclusivement, fourni par le glutathion (GSH), un tripeptide composé des acides aminés non essentiels : glycine, glutamate et cystéine. L’acide aminé limitant le taux de biosynthèse du GSH est la cystéine4. Bien que la cystéine soit classée comme un acide aminé non essentiel, ses besoins peuvent facilement dépasser sa production interne dans les cellules hautement prolifératives (telles que les cellules cancéreuses). Il a donc été reclassé dans le groupe des acides aminés semi-essentiels. L’importation nécessaire de cystéine se produit principalement par le biais du système Xc-, qui permet l’importation de la forme oxydée (dominante) de la cystéine (alias cystine) au détriment de l’exportation de glutamate5. Le système Xc- est composé d’une sous-unité de transport indépendante du Na+ et dépendante de Cl, connue sous le nom de xCT, et d’une sous-unité chaperonne, connue sous le nom de CD98. Jusqu’à récemment, les propriétés anti-ferroptotiques de l’axe xCT-GSH-GPx4 étaient considérées comme uniques et irréplicables6. Cependant, en 2019, une voie alternative anti-ferroptotique, composée d’ubiquinol (coenzyme Q10) et de son enzyme régénérative – la protéine suppressive de ferroptose 1 (FSP1), a été décrite 7,8. Peu de temps après, un autre système de détoxification à base d’hydroperoxyde lipidique impliquant la GTP cyclohydrolase-1/tétrahydrobioptérine (GCH1/BH4) a été signalé9. Néanmoins, le rôle central de l’axe xCT-GSH-GPx4 dans la prévention de la ferroptose ne semble pas être remis en question.
Au cours de la dernière décennie, la ferroptose a été largement étudiée dans une variété de types de tumeurs, montrant un grand potentiel en tant que stratégie anticancéreuse (examiné par Lei et al.10). De plus, il a été rapporté que les cellules cancéreuses présentant une résistance élevée aux chimiothérapies conventionnelles et/ou une propension à métastaser sont étonnamment sensibles aux inducteurs de ferroptose, tels que les inhibiteurs de GPx4 11,12,13. Cependant, dans le contexte des tumeurs cérébrales, le potentiel des inducteurs ferroptotiques reste largement sous-étudié. Bien que ce type de mort cellulaire ait été étroitement associé aux lésions d’ischémie-reperfusion cérébrale14et aux maladies neurodégénératives15, son potentiel dans le contexte des tumeurs cérébrales a principalement été limité au glioblastome, la tumeur craniocérébrale maligne la plus courante (examiné par Zhuo et al.16). D’autre part, la sensibilité du médulloblastome, la tumeur cérébrale maligne pédiatrique la plus courante et l’une des principales causes de mortalité infantile, aux inducteurs de ferroptose reste largement inexplorée. À notre connaissance, il existe peu de littérature évaluée par des pairs établissant un lien entre la ferroptose et le médulloblastome. Néanmoins, certaines études ont révélé que le fer joue un rôle crucial dans la survie, la prolifération et le potentiel tumorigène des cellules souches cancéreuses du médulloblastome et du glioblastome (CSC)17,18, ce qui les rend potentiellement plus vulnérables à l’induction de la ferroptose. Ceci est particulièrement important car le médulloblastome est connu pour sa sous-population de CSC, ou cellules initiatrices/propagatrices de tumeurs, qui semblent être en grande partie responsables de la chimiorésistance, de la dissémination et de la rechute des tumeurs19.
La sensibilité à l’induction de la ferroptose est généralement étudiée en mesurant la teneur/l’accumulation d’hydroperoxyde lipidique, qui peut ou non conduire à la mort cellulaire. Les inducteurs de ferroptose les plus couramment utilisés sont (1) l’ératine, un inhibiteur du transporteur xCT20, (2) RSL3, un inhibiteur de l’enzyme GPx42, et/ou (3) les donneurs de fer, tels que le citrate de ferro-ammonium (FAC)21. La teneur en hydroperoxyde lipidique est évaluée à l’aide de la sonde sélective BODIPY 581/591 C1122, qui a des maxima d’excitation et d’émission à 581/591 nm à l’état réduit. Lors de l’interaction et de l’oxydation par les hydroperoxydes lipidiques, la sonde décale ses maxima d’excitation et d’émission à 488/510 nm. En règle générale, une augmentation significative de la teneur en hydroperoxyde lipidique précède la mort cellulaire ferroptotique. Comme la ferroptose n’est pas une mort cellulaire programmée, il n’y a pas de cascade de signalisation moléculaire menant à son exécution. Par conséquent, la seule façon de le confirmer est de surveiller la teneur en hydroperoxyde lipidique et d’utiliser des inhibiteurs spécifiques de ce type de mort cellulaire, tels que la ferrostatine 123. La ferrostatine 1 est un antioxydant lipophile qui peut pénétrer dans le compartiment lipidique de la cellule et détoxifier les hydroperoxydes lipidiques, prévenant ainsi les événements ferroptotiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principale caractéristique de la mort cellulaire ferroptotique est l’accumulation incontrôlée d’hydroperoxydes lipidiques dans la membrane plasmique. Ces dommages oxydatifs peuvent se produire de manière enzymatique ou non enzymatique, mais dans les deux cas, la réaction est dépendante du fer/catalysée, d’où le nom de ce type de mort cellulaire. L’hydroperoxydation lipidique est souvent estimée indirectement en mesurant les produits de dégradation de l’hydroperoxydation lipidique, tels que le 4-hyd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le gouvernement de la Principauté de Monaco, ainsi que par le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer (GEMLUC) et la Fondation Flavien, qui ont fourni les moyens de l’achat de BD FACS Melody.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
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