Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.
Взаимодействие железа и кислорода является неотъемлемой частью развития жизни на Земле. Тем не менее, эта уникальная химия продолжает очаровывать и озадачивать, приводя к новым биологическим предприятиям. В 2012 году группа из Колумбийского университета признала это взаимодействие центральным событием, ведущим к новому типу регулируемой клеточной смерти, названному «ферроптозом». Основной особенностью ферроптоза является накопление гидропероксидов липидов вследствие (1) дисфункциональной антиоксидантной защиты и/или (2) подавляющего окислительного стресса, который чаще всего совпадает с повышенным содержанием свободного лабильного железа в клетке. Обычно это предотвращается канонической антиферроптозной осью, содержащей транспортер цистина xCT, глутатион (GSH) и пероксидазу GSH 4 (GPx4). Поскольку ферроптоз не является запрограммированным типом клеточной смерти, он не включает в себя сигнальные пути, характерные для апоптоза. Наиболее распространенным способом доказать этот тип клеточной смерти является использование липофильных антиоксидантов (витамин Е, ферростатин-1 и т.д.) для ее предотвращения. Эти молекулы могут приближаться к окислительному повреждению плазматической мембраны и выводить его из токсина. Другим важным аспектом в выявлении ферроптотического фенотипа является обнаружение предшествующего накопления гидропероксидов липидов, для чего используется специфический краситель BODIPY C11. В настоящей рукописи будет показано, как ферроптоз может быть индуцирован в клетках медуллобластомы дикого типа с помощью различных индукторов: эрантина, RSL3 и донора железа. Аналогичным образом, будут использоваться клетки xCT-KO, которые растут в присутствии NAC и которые подвергаются ферроптозу после удаления NAC. Характерный «пузырчатый» фенотип виден под световым микроскопом в течение 12-16 ч с момента запуска ферроптоза. Кроме того, будет использовано окрашивание BODIPY C11 с последующим анализом FACS, чтобы показать накопление гидропероксидов липидов и последующую гибель клеток с использованием метода окрашивания PI. Чтобы доказать ферроптотическую природу клеточной гибели, ферростатин-1 будет использоваться в качестве специфического средства, предотвращающего ферроптоз.
Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти1. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название2. Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточной мембране препятствует антиоксидантная защита клетки. Основным игроком в этом контексте является Se-протеин глутатионпероксидаза 4 (GPx4), которая может приближаться к мембране и превращать гидропероксиды липидов в их менее токсичные производные алкоголя3. Восстановительная способность GPx4 в основном, но не исключительно, обеспечивается глутатионом (GSH), трипептидом, состоящим из заменимых аминокислот: глицина, глутамата и цистеина. Ограничивающей скорость аминокислотой для биосинтеза GSH является цистеин4. Хотя цистеин классифицируется как заменимая аминокислота, его потребности могут легко превышать его внутреннее производство в клетках с высокой степенью пролиферации (например, раковых клетках). Таким образом, он был реклассифицирован в группу полузаменимых аминокислот. Необходимый импорт цистеина происходит в основном через Xc-систему, которая позволяет импортировать окисленную (доминирующую) форму цистеина (он же цистин) засчет экспорта глутамата5. Xc-система состоит из Na+-независимой, Cl-зависимой транспортной субъединицы, известной как xCT, и шаперонной субъединицы, известной как CD98. До недавнего времени антиферроптозные свойства оси xCT-GSH-GPx4 считались уникальными и невоспроизводимыми6. Однако в 2019 годубыл описан альтернативный антиферроптозный путь, состоящий из убихинола (Coenzyme Q10) и его регенеративного фермента – белка-супрессора ферроптоза 1 (FSP1), 7,8. Вскоре после этого сообщалось о еще одной системе детоксикации гидропероксида липидов, включающей циклогидролазу ГТФ-1/тетрагидробиоптерин (GCH1/BH4)9. Тем не менее, центральная роль оси xCT-GSH-GPx4 в профилактике ферроптоза, по-видимому, не оспаривается.
За последнее десятилетие ферроптоз широко изучался при различных типах опухолей, демонстрируя большой потенциал в качестве противораковой стратегии (обзор Lei et al.10). Кроме того, сообщалось, что раковые клетки, проявляющие высокую устойчивость к обычным химиотерапевтическим средствам и/или склонность к метастазированию, удивительно чувствительны к индукторам ферроптоза, таким как ингибиторы GPx4 11,12,13. Однако в контексте опухолей головного мозга потенциал ферроптозных индукторов остается в значительной степени малоизученным. В то время как этот тип клеточной гибели тесно связан с церебральной ишемией-реперфузионной травмой14и нейродегенеративными заболеваниями15, его потенциал в контексте опухолей головного мозга в основном ограничен глиобластомой, наиболее распространенной злокачественной черепно-мозговой опухолью (обзор Zhuo et al.16). С другой стороны, чувствительность медуллобластомы, наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга у детей и ведущей причины детской смертности, к индукторам ферроптоза остается в значительной степени неизученной. Насколько нам известно, существует мало рецензируемой литературы, связывающей ферроптоз и медуллобластому. Тем не менее, некоторые исследования показали, что железо играет решающую роль в выживании, пролиферации и онкогенном потенциале стволовых клеток (ОСК) медуллобластомы и глиобластомы17,18, потенциально делая их более уязвимыми к индукции ферроптоза. Это особенно важно, поскольку медуллобластома печально известна своей субпопуляцией ОСК, или клеток, инициирующих/размножающихся опухолью, которые, по-видимому, в значительной степени ответственны за химиорезистентность, диссемицию и рецидив опухоли19.
Чувствительность к индукции ферроптоза обычно исследуется путем измерения содержания/накопления гидропероксида липидов, что может привести или не привести к гибели клеток. Наиболее часто используемыми индукторами ферроптоза являются (1) эрастин, ингибитор транспортера xCT20, (2) RSL3, ингибитор фермента GPx42 и/или (3) доноры железа, такие как цитрат ферроаммония (FAC)21. Содержание гидропероксида липидов оценивают с помощью селективного зонда BODIPY 581/591 C1122, который в восстановленном состоянии имеет максимумы возбуждения и излучения на длине волны 581/591 нм. При взаимодействии с гидропероксидами липидов и их окислении зонд смещает максимумы возбуждения и излучения до 488/510 нм. Как правило, значительное увеличение содержания гидропероксида липидов предшествует гибели ферроптозных клеток. Поскольку ферроптоз не является запрограммированной клеточной смертью, не существует молекулярного сигнального каскада, ведущего к его осуществлению. Поэтому единственным способом подтвердить это является контроль содержания гидропероксида липидов и использование специфических ингибиторов для этого типа клеточной гибели, таких как ферростатин 123. Ферростатин 1 является липофильным антиоксидантом, который может проникать в липидный компартмент клетки и выводить токсины гидропероксидов липидов, тем самым предотвращая ферроптозные события.
Основным признаком гибели ферроптозных клеток является неконтролируемое накопление гидропероксидов липидов в плазматической мембране. Это окислительное повреждение может происходить ферментативным или неферментативным способом, но в любом случае реакция является железозависимой…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана правительством Княжества Монако, а также организацией «Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer» (GEMLUC) и фондом Flavien, который предоставил средства для покупки BD FACS Melody.
BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
.