髄芽腫のフェロトーシス表現型の解明
Summary
脂質ヒドロペルオキシド含有量は、フェロトーシス細胞死の最も一般的に使用される指標です。この記事では、フェロトーシス誘導時の細胞内の脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリーの段階的な分析について説明します。
Abstract
鉄と酸素の相互作用は、地球上の生命の発達に不可欠な部分です。それにもかかわらず、このユニークな化学は魅了され、困惑し続け、新しい生物学的ベンチャーにつながります。2012年、コロンビア大学のグループは、この相互作用が「フェロトーシス」と呼ばれる新しいタイプの制御細胞死につながる中心的なイベントであると認識しました。フェロトーシスの主な特徴は、(1)機能不全の抗酸化防御および/または(2)圧倒的な酸化ストレスによる脂質ヒドロペルオキシドの蓄積であり、これは最も頻繁に細胞内の遊離不安定鉄の含有量の増加と一致します。これは通常、シスチントランスポーターxCT、グルタチオン(GSH)、およびGSHペルオキシダーゼ4(GPx4)を含む標準的な抗フェロトーシス軸によって防止されます。フェロトーシスはプログラムされたタイプの細胞死ではないため、アポトーシスに特徴的なシグナル伝達経路は関与しません。このタイプの細胞死を証明する最も一般的な方法は、親油性抗酸化物質(ビタミンE、フェロスタチン-1など)を使用して細胞死を防ぐことです。これらの分子は、原形質膜の酸化的損傷に接近し、解毒することができます。フェロトーシスの表現型を明らかにする上でのもう一つの重要な側面は、特定の色素BODIPY C11が使用される脂質ヒドロペルオキシドの先行蓄積を検出することです。本稿では、エラスチン、RSL3、鉄供与体などのさまざまな誘導物質を使用して、野生型髄芽腫細胞でフェロトーシスを誘導する方法を示します。同様に、NACの存在下で増殖し、NACが除去されるとフェロトーシスを受けるxCT-KO細胞が使用されます。特徴的な「バブリング」表現型は、フェロトーシスが引き起こされた瞬間から12〜16時間以内に光学顕微鏡で見ることができます。さらに、PI染色法を使用して脂質ヒドロペルオキシドの蓄積とその結果としての細胞死を示すためのBODIPY C11染色とそれに続くFACS分析が使用されます。細胞死のフェロトーシス特性を証明するために、フェロスタチン-1 は特定のフェロトーシス予防剤として使用されます。
Introduction
フェロトーシスは、新たに状況化された活性酸素種(ROS)依存型の細胞死1です。ROSに加えて、鉄はこのタイプの細胞死において重要な役割を果たしているため、2という名前が付けられています。フェロトーシスの最終的かつ実行的なステップは、鉄触媒による脂質の酸化的損傷の細胞膜への蓄積であり、最終的には膜の完全性と選択的透過性の低下、そして最終的にはバブリングによる細胞死につながります。脂質のヒドロ過酸化イベントは自然に発生する現象です。しかしながら、細胞膜全体へのその伝播は、細胞の抗酸化防御によって妨げられる。この文脈での主要なプレーヤーは、Se-タンパク質グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPx4)であり、膜に接近して脂質ヒドロペルオキシドを毒性の低いアルコール誘導体に変換することができます3。GPx4の還元力は、主に非必須アミノ酸(グリシン、グルタミン酸、システイン)で構成されるトリペプチドであるグルタチオン(GSH)によって提供されますが、これに限定されません。GSHの生合成のための律速アミノ酸はシステイン4です。システインは非必須アミノ酸として分類されますが、その必要量は、増殖性の高い細胞(がん細胞など)では容易に内部産生を超える可能性があります。したがって、半必須アミノ酸のグループに再分類されました。システインの必要な輸入は、主にXc-システムを通じて行われ、これにより、グルタミン酸の輸出を犠牲にして、酸化された(支配的な)形態のシステイン(別名シスチン)の輸入が可能になります5。Xc-システムは、xCTとして知られるNa+非依存性Cl依存性の輸送サブユニットと、CD98として知られるシャペロンサブユニットで構成されています。最近まで、xCT-GSH-GPx4軸の抗フェロトーシス特性は、ユニークで再現不可能であると考えられてきました6。しかし、2019年には、ユビキノール(コエンザイムQ10)とその再生酵素であるフェロトーシス抑制タンパク質1(FSP1)からなる代替の抗フェロトーシス経路が記載されています7,8。その後まもなく、GTPシクロヒドロラーゼ-1/テトラヒドロビオプテリン(GCH1/BH4)を含む脂質ヒドロペルオキシド解毒システムがさらに報告されています9。それにもかかわらず、フェロトーシスの予防におけるxCT-GSH-GPx4軸の中心的な役割は挑戦されていないようです。
過去 10 年間で、フェロトーシスはさまざまな種類の腫瘍で広く研究され、抗がん戦略として大きな可能性を示しています (Lei et al.10 によるレビュー)。さらに、従来の化学療法に対して高い耐性を示すがん細胞や転移傾向を示すがん細胞は、GPx4の阻害剤などのフェロトーシス誘導物質に対して驚くほど感受性が高いことが報告されています11,12,13。しかし、脳腫瘍の文脈では、フェロトーシス誘導剤の可能性は依然としてほとんど研究されていません。このタイプの細胞死は、脳虚血再灌流障害14および神経変性疾患15と密接に関連していますが、脳腫瘍の文脈でのその可能性は、主に最も一般的な悪性頭蓋脳腫瘍である膠芽腫に限定されています(Zhuoらによるレビュー16)。一方、最も一般的な悪性小児脳腫瘍であり、小児死亡の主な原因である髄芽腫のフェロトーシス誘導物質に対する感受性は、ほとんど解明されていません。私たちの知る限りでは、フェロトーシスと髄芽腫を関連付ける査読済みの文献はほとんどありません。それにもかかわらず、いくつかの研究は、鉄が髄芽腫と膠芽腫がん幹細胞(CSC)の両方の生存、増殖、および腫瘍形成の可能性に重要な役割を果たしていることを明らかにしています17,18、潜在的にそれらをフェロトーシス誘導に対してより脆弱にします。髄芽腫は、CSC、または腫瘍開始/増殖細胞の亜集団で悪名高く、腫瘍の化学療法抵抗性、播種、および再発に大きく関与していると思われるため、これは特に重要です19。
フェロトーシス誘導に対する感度は、通常、脂質ヒドロペルオキシドの含有量/蓄積を測定することによって調査されますが、これは細胞死につながる場合とそうでない場合があります。最も一般的に使用されるフェロトーシス誘導物質は、(1)xCTトランスポーター20の阻害剤であるエラスチン、(2)GPx4酵素2の阻害剤であるRSL3、および/または(3)クエン酸フェロアンモニウム(FAC)21などの鉄供与体である。脂質ヒドロペルオキシド含有量は、選択的プローブBODIPY 581/591 C1122を使用して評価されます。このプローブは、還元状態で581/591 nmに励起および発光が最大です。脂質ヒドロペルオキシドとの相互作用と酸化により、プローブはその励起および発光の最大値を488/510 nmにシフトします。通常、脂質ヒドロペルオキシド含有量の大幅な増加は、フェロトーシス細胞死に先行します。フェロトーシスはプログラムされた細胞死ではないため、その実行につながる分子シグナル伝達カスケードはありません。したがって、それを確認する唯一の方法は、脂質ヒドロペルオキシド含有量を監視し、このタイプの細胞死に対してフェロスタチン123などの特定の阻害剤を使用することです。フェロスタチン1は、細胞の脂質コンパートメントに浸透し、脂質ヒドロペルオキシドを解毒し、それによってフェロトーシスイベントを防止できる親油性抗酸化物質です。
Protocol
Representative Results
Discussion
フェロトーシス細胞死の主な特徴は、原形質膜における脂質ヒドロペルオキシドの制御不能な蓄積です。この酸化的損傷は、酵素的または非酵素的な方法で発生する可能性がありますが、いずれの場合も、反応は鉄依存性/触媒性であり、これがこのタイプの細胞死の名前を説明しています。脂質のヒドロペルオキシドは、4-ヒドロキシ-2,3-トランス-ノネナール(4-HNE)やマロヌアルデヒド(MDA)な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この活動は、モナコ公国政府、GEMLUC(Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer)、フラヴィアン財団の支援を受け、BD FACS Melodyの購入手段を提供しました。
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
References
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