Rivelare il fenotipo ferroptotico del medulloblastoma

Summary

Il contenuto di idroperossido lipidico rappresenta l’indicatore più comunemente usato della morte cellulare ferroptotica. Questo articolo dimostra l’analisi passo-passo della citometria a flusso del contenuto di idroperossido lipidico nelle cellule dopo induzione della ferroptosi.

Abstract

L’interazione tra ferro e ossigeno è parte integrante dello sviluppo della vita sulla Terra. Ciononostante, questa chimica unica continua ad affascinare e confondere, portando a nuove imprese biologiche. Nel 2012, un gruppo della Columbia University ha riconosciuto questa interazione come un evento centrale che porta a un nuovo tipo di morte cellulare regolata chiamata “ferroptosi”. La caratteristica principale della ferroptosi è l’accumulo di idroperossidi lipidici dovuto a (1) una difesa antiossidante disfunzionale e/o (2) uno stress ossidativo schiacciante, che coincide più frequentemente con un aumento del contenuto di ferro labile libero nella cellula. Questo è normalmente impedito dall’asse anti-ferroptotico canonico che comprende il trasportatore della cistina xCT, il glutatione (GSH) e la GSH perossidasi 4 (GPx4). Poiché la ferroptosi non è un tipo programmato di morte cellulare, non coinvolge le vie di segnalazione caratteristiche dell’apoptosi. Il modo più comune per dimostrare questo tipo di morte cellulare è l’uso di antiossidanti lipofili (vitamina E, ferrostatina-1, ecc.) per prevenirla. Queste molecole possono avvicinarsi e detossificare il danno ossidativo nella membrana plasmatica. Un altro aspetto importante nella rivelazione del fenotipo ferroptotico è la rilevazione del precedente accumulo di idroperossidi lipidici, per il quale viene utilizzato il colorante specifico BODIPY C11. Il presente manoscritto mostrerà come la ferroptosi possa essere indotta in cellule di medulloblastoma wild-type utilizzando diversi induttori: erastina, RSL3 e donatore di ferro. Allo stesso modo, verranno utilizzate le cellule xCT-KO che crescono in presenza di NAC e che subiscono la ferroptosi una volta rimossa la NAC. Il caratteristico fenotipo “gorgogliante” è visibile al microscopio ottico entro 12-16 ore dal momento in cui si è innescata la ferroptosi. Inoltre, verrà utilizzata la colorazione BODIPY C11 seguita dall’analisi FACS per mostrare l’accumulo di idroperossidi lipidici e la conseguente morte cellulare utilizzando il metodo di colorazione PI. Per dimostrare la natura ferroptotica della morte cellulare, la ferrostatina-1 sarà utilizzata come agente specifico per prevenire la ferroptosi.

Introduction

La feroptosi è un tipo di morte cellulare reattivo dipendente dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS)^{1 di} recente. Oltre ai ROS, il ferro svolge un ruolo cruciale in questo tipo di morte cellulare, da cui il nome². La fase finale ed esecutiva della ferroptosi è l’accumulo catalizzato dal ferro del danno ossidativo dei lipidi nella membrana plasmatica che alla fine porta alla compromissione dell’integrità della membrana e della permeabilità selettiva e, infine, alla morte cellulare per bolle. L’evento di idroperossidazione lipidica è un fenomeno naturale; Tuttavia, la sua propagazione in tutta la membrana cellulare è impedita dalla difesa antiossidante della cellula. Il principale attore in questo contesto è la proteina Se glutatione perossidasi 4 (GPx4), che può avvicinarsi alla membrana e convertire gli idroperossidi lipidici nei loro derivati alcolici meno tossici³. Il potere riducente della GPx4 è fornito principalmente, ma non esclusivamente, dal glutatione (GSH), un tripeptide composto da aminoacidi non essenziali: glicina, glutammato e cisteina. L’aminoacido limitante per la biosintesi del GSH è la cisteina⁴. Sebbene la cisteina sia classificata come aminoacido non essenziale, il suo fabbisogno può facilmente superare la sua produzione interna nelle cellule altamente proliferative (come le cellule tumorali). Per questo motivo è stato riclassificato nel gruppo degli aminoacidi semi-essenziali. L’importazione necessaria di cisteina avviene principalmente attraverso il sistema Xc-, che consente l’importazione della forma ossidata (dominante) di cisteina (nota anche come cistina) a scapito dell’esportazione di glutammato⁵. Il sistema Xc- è composto da una subunità di trasporto Na+-indipendente, dipendente da Cl, nota come xCT, e da una subunità chaperon, nota come CD98. Fino a poco tempo fa, le proprietà antiferroptotiche dell’asse xCT-GSH-GPx4 sono state viste come uniche e irreplicabili⁶. Tuttavia, nel 2019, è stata descritta una via anti-ferroptotica alternativa, costituita dall’ubichinolo (Coenzima Q10) e dal suo enzima rigenerativo – la proteina soppressore della ferroptosi 1 (FSP1), ^7,8. Poco dopo, è stato riportato un altro sistema disintossicante dell’idroperossido lipidico che coinvolge GTP cicloidrolasi-1/tetraidrobiopterina (GCH1/BH4)⁹. Ciononostante, il ruolo centrale dell’asse xCT-GSH-GPx4 nella prevenzione della ferroptosi non sembra essere messo in discussione.

Nell’ultimo decennio, la ferroptosi è stata ampiamente studiata in una varietà di tipi di tumore, mostrando un grande potenziale come strategia antitumorale (rivisto da Lei et ^al.10). Inoltre, è stato riportato che le cellule tumorali che mostrano un’elevata resistenza ai chemioterapici convenzionali e/o una propensione a metastatizzare sono sorprendentemente sensibili agli induttori della ferroptosi, come gli inibitori della GPx4 11,12,13. Tuttavia, nel contesto dei tumori cerebrali, il potenziale degli induttori ferroptotici rimane ampiamente poco studiato. Mentre questo tipo di morte cellulare è stato strettamente associato al danno da ischemia-riperfusione cerebrale¹⁴e alle malattie neurodegenerative¹⁵, il suo potenziale nel contesto dei tumori cerebrali è stato principalmente limitato al glioblastoma, il tumore craniocerebrale maligno più comune (rivisto da Zhuo et ^al.16). D’altra parte, la sensibilità del medulloblastoma, il più comune tumore maligno pediatrico al cervello e una delle principali cause di mortalità infantile, agli induttori della ferroptosi rimane in gran parte inesplorata. Per quanto ne sappiamo, esiste una scarsa letteratura peer-reviewed che collega ferroptosi e medulloblastoma. Tuttavia, alcuni studi hanno rivelato che il ferro svolge un ruolo cruciale nella sopravvivenza, nella proliferazione e nel potenziale tumorigenico delle cellule staminali tumorali (CSC) sia del medulloblastoma che del glioblastoma17,18, rendendole potenzialmente più vulnerabili all’induzione della ferroptosi. Ciò è particolarmente significativo in quanto il medulloblastoma è noto per la sua sottopopolazione di CSC, o cellule che iniziano/propagano il tumore, che sembrano essere in gran parte responsabili della chemioresistenza, della disseminazione e della recidiva del tumore¹⁹.

La sensibilità all’induzione della ferroptosi è tipicamente studiata misurando il contenuto/accumulo di idroperossido lipidico, che può o meno portare alla morte cellulare. Gli induttori della ferroptosi più comunemente usati sono (1) la erastina, un inibitore del trasportatore xCT²⁰, (2) RSL3, un inibitore dell’enzima GPx4² e/o (3) donatori di ferro, come il citrato ferro-ammonico (FAC)²¹. Il contenuto di idroperossido lipidico viene valutato utilizzando la sonda selettiva BODIPY 581/591 C11²², che ha massimi di eccitazione ed emissione a 581/591 nm nel suo stato ridotto. In seguito all’interazione e all’ossidazione da parte degli idroperossidi lipidici, la sonda sposta i suoi massimi di eccitazione ed emissione a 488/510 nm. Tipicamente, un aumento significativo del contenuto di idroperossido lipidico precede la morte cellulare ferroptotica. Poiché la ferroptosi non è una morte cellulare programmata, non esiste una cascata di segnali molecolari che porti alla sua esecuzione. Pertanto, l’unico modo per confermarlo è monitorare il contenuto di idroperossido lipidico e utilizzare inibitori specifici per questo tipo di morte cellulare, come la ferrostatina 1²³. La ferrostatina 1 è un antiossidante lipofilo in grado di penetrare nel compartimento lipidico della cellula e detossificare gli idroperossidi lipidici, prevenendo così gli eventi ferroptotici.

Protocol

Il presente studio è stato condotto utilizzando linee cellulari di medulloblastoma DAOY wild-type (WT), che sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO2 in terreno DMEM integrato con l’8% di FBS. La linea cellulare deleta con xCT è stata mantenuta nelle stesse condizioni, con esperimenti condotti in terreni integrati con 1 mM di N-acetilcisteina (NAC). Le cellule sono state regolarmente sottoposte a screening per micoplasma utilizzando un kit di rilevamento del micoplasma disponibile in commercio (vedi <st…

Representative Results

La linea cellulare di medulloblastoma DAOY è stata coltivata in un terreno DMEM standard integrato con FBS all’8% fino a raggiungere circa il 60% di confluenza. Il giorno dell’esperimento, le cellule sono state raccolte e 1.000.000 di cellule per pozzetto sono state piastrate in piastre a 6 pozzetti, secondo la Tabella 1. Il giorno seguente, le cellule (in triplicato) sono state trattate con 1 μM di erastina, 0,3 μM di RSL3 o 250 μM di FAC. Le piastre sono state quindi poste nell’incubatore a 37 °C …

Discussion

Il segno distintivo primario della morte cellulare ferroptotica è l’accumulo incontrollato di idroperossidi lipidici nella membrana plasmatica. Questo danno ossidativo può verificarsi in modo enzimatico o non enzimatico, ma in entrambi i casi la reazione è ferro-dipendente/catalizzata, il che spiega il nome di questo tipo di morte cellulare. L’idroperossidazione lipidica è spesso stimata indirettamente misurando i prodotti di degradazione dell’idroperossidazione lipidica, come il 4-idrossi-2,3-trans-nonenale (4-HNE) …

Materials

BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin – EDTA 10X – 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100