Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione
Summary
Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.
Abstract
Transgenici Caenorhabditis elegans possono essere facilmente create tramite microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in gonade 1. Il DNA plasmidico riorganizza per formare concatamers extracromosomico che sono stabilmente ereditato, anche se non con la stessa efficienza di cromosomi effettivo 2. Un gene di interesse è co-iniettata con un marker fenotipici evidenti, come ad esempio rol-6 o GFP, per consentire la selezione di animali transgenici sotto un microscopio da dissezione. Il gene esogeno può essere espresso dal suo promotore nativo per gli studi di localizzazione cellulare. In alternativa, il transgene può essere guidata da un diverso tessuto-specifica promotore di valutare il ruolo del prodotto genico in quella cella particolare o tessuto. Questa tecnica di guida in modo efficiente l'espressione genica in tutti i tessuti del C. elegans, tranne per l'embrione linea germinale o ai primi 3. Creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata per una vasta gamma di paradigmi sperimentali. Questo video mostra la procedura di microiniezione di generare vermi transgenici. Inoltre, la selezione e la manutenzione di stabili transgenici C. elegans linee è descritto.
Protocol
Discussion
Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di:
– Iniettare direttamente nel centro della gonade
– Non iniettare liquidi troppo
– Lavorare velocemente per evitare essiccazione.
Se si verificano problemi con l'ago, come si è rotto troppo grande, è meglio rifare un ago fresco, piuttosto che cercare di iniettare con meno di aghi ideale.
La generazione di vermi transgenici ha molte applicazioni quali:
– Identificazione di geni mutanti, nel metodo chiamato soccorso trasformazione …
Acknowledgements
Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell'Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Génétique. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
