Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección
Summary
Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.
Abstract
Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada 1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual 2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal 3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.
Protocol
Discussion
Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente:
– Inyectar directamente en el centro de la gónada
– No inyectar demasiado líquido
– Trabajar con rapidez para evitar la desecación.
Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal.
La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como:
– La identificación de genes mutantes…
Acknowledgements
Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de pregrado.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Génétique. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
