Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção
Summary
Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.
Abstract
Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o 1 gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais 2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal 3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.
Protocol
Discussion
Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de:
– Injectar directamente no centro da gônada
– Não injetar muito líquido
– Trabalhar com rapidez para evitar dessecação.
Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal.
A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como:
– Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transf…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Génétique. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
