الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب
Summary
من خلال استخدام التصوير الطيفي المجهري اثنين الفوتون النظام ، ويتم الحصول على بكسل المستوى خرائط لنقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) معربا عن كفاءات لخلايا مستقبلات الغشاء المفترضة لتشكيل هومو oligomeric المجمعات. من الحنق خرائط الكفاءة ، ونحن قادرون على تقدير متكافئة معلومات عن مركب قليل وحدات قيد الدراسة.
Abstract
دراسة التفاعلات البروتين في الخلايا الحية مجالا هاما للبحث لأن المعلومات التي تراكمت فوائد التطبيقات الصناعية على حد سواء فضلا عن زيادات الأساسية المعرفة البيولوجية الأساسية. وقد فورستر للطاقة الرنين (الإسفار) نقل (الحنق) بين جزيء المانحة في حالة مثارة الكترونيا ومتقبل جزيء قريب تستخدم بشكل متكرر للدراسات من البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية. والموسومة البروتينات في المصالح مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت وأعرب في الخلايا البيولوجية. نحن متحمسون ثم تحقيقات الفلورسنت ، وعادة باستخدام أشعة الليزر ، ويتم جمع الخصائص الطيفية من الانبعاثات الصادرة عن مضان تحقيقات الفلورسنت وتحليلها. يتم تضمين المعلومات المتعلقة درجة التفاعل البروتين في بيانات الانبعاثات الطيفية. عادة ، يجب أن تفحص الخلية عددا من المرات من أجل تجميع المعلومات الطيفية كافية لتحديد دقيق لمدى التفاعل البروتين لكل منطقة من المصالح داخل الخلية. ومع ذلك ، قد التكوين الجزيئي لتغيير هذه المناطق خلال عملية الاستحواذ ، مما يحد من عزم المكانية من القيم الكمية للكفاءات الحنق على ما يبدو الى ما معدله أكثر من الخلايا بأكمله. عن طريق الميكروسكوب ثنائي الفوتون الطيفي ، ونحن قادرون على الحصول على مجموعة كاملة من الصور الطيفي واحد فقط بعد فحص الإثارة الكاملة للعينة من الفائدة. من هذه البيانات بكسل المستوى الطيفي ، وخريطة لالحنق وتحسب الكفاءة في جميع أنحاء الخلية. من خلال تطبيق نظرية بسيطة من الحنق في المجمعات oligomeric للتوزيع التي تم الحصول عليها تجريبيا من الحنق الكفاءة في جميع أنحاء الخلية ، وهو واحد تفحص الطيفي يكشف عن معلومات حول القياس المتكافئ والهيكلية المعقدة قليل وحدات قيد الدراسة. نحن هنا وصف الإجراء إعداد الخلايا البيولوجية (خميرة السكيراء الخميرة) معربا عن غشاء المستقبلات (2 العقيمة α مستقبلات عامل) الموسومة مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت. علاوة على ذلك ، نحن لتوضيح العوامل الحاسمة التي ينطوي عليها جمع البيانات مضان الطيفي باستخدام التصوير المجهري اثنين الفوتون النظام. ويجوز تمديد استخدام هذا البروتوكول لدراسة أي نوع من البروتين الذي يمكن التعبير عنه في الخلية الحية مع علامة فلوري مرفقة به.
Protocol
Discussion
في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية تحديد حجم والمعلومات حول الهيكلية بروتين قليل وحدات معقدة في الجسم الحي. في حين تم الحصول على البيانات المقدمة من الغشاء مستقبلات محددة (أي Ste2p) التي أعرب عنها في خلايا الخميرة ، فإن هذه الطريقة تشمل كل ما في ويمكن تطبيقه على أي نوع م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من مبادرة بحوث النمو يسكونس ميلووكي ، ويسكونسن لمعهد الطب الحيوي والتكنولوجيا والصحة ، ومؤسسة برادلي.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Riferimenti
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
