Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons
Summary
En employant une résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique, au niveau des pixels des cartes de transfert de Förster Resonance Energy (FRET) efficacités sont obtenues pour des cellules exprimant des récepteurs membranaires hypothèse de former des homo-oligomères complexes. Depuis le FRET cartes d'efficacité, nous sommes en mesure d'estimer l'information sur le complexe stoechiométrique oligomère à l'étude.
Abstract
L'étude des interactions entre protéines dans les cellules vivantes est un domaine de recherche important parce que les informations accumulées à la fois les applications retombées industrielles ainsi que des augmentations de base de connaissances biologiques fondamentaux. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) entre une molécule bailleurs de fonds dans un état électroniquement excité et une molécule d'accepteur à proximité a été fréquemment utilisée pour des études d'interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. Les protéines d'intérêt sont étiquetés avec deux différents types de sondes fluorescentes et exprimée dans les cellules biologiques. Les sondes fluorescentes sont alors excités, typiquement en utilisant la lumière laser, et les propriétés spectrales de l'émission de fluorescence émanant des sondes fluorescentes sont recueillies et analysées. L'information concernant le degré des interactions protéine est ancrée dans les données d'émission spectrale. Typiquement, la cellule doit être balayé un certain nombre de fois afin d'accumuler suffisamment d'informations spectrales de quantifier avec précision l'étendue des interactions protéine pour chaque région d'intérêt dans la cellule. Cependant, la composition moléculaire de ces régions peuvent changer au cours du processus d'acquisition, de limiter la détermination spatiale des valeurs quantitatives de l'efficacité apparente de FRET à une moyenne sur des cellules entières. Par le biais d'une résolution spectrale de microscope à deux photons, nous sommes en mesure d'obtenir un ensemble complet d'images spectralement résolue après un seul balayage d'excitation complète de l'échantillon d'intérêt. Partir de ces données au niveau des pixels spectrale, une carte de l'efficacité de FRET dans toute la cellule est calculée. En appliquant une simple théorie du FRET dans des complexes oligomériques à la distribution obtenues expérimentalement l'efficacité de FRET à travers la cellule, un seul balayage résolution spectrale révèle l'information stoechiométrique et structurelles sur le complexe oligomère à l'étude. Nous décrivons ici la procédure de préparation des cellules biologiques (la levure Saccharomyces cerevisiae) exprimant des récepteurs membranaires (stérile 2 α-facteur de récepteurs) taggés avec deux différents types de sondes fluorescentes. Par ailleurs, nous illustrons facteurs critiques impliqués dans la collecte de données de fluorescence à l'aide de la résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique. L'utilisation de ce protocole peut être étendu pour étudier tout type de protéine qui peut être exprimé dans une cellule vivante avec un marqueur fluorescent qui s'y rattachent.
Protocol
Discussion
Dans cette présentation, nous avons illustré comment déterminer la taille et l'information structurelle sur un complexe oligomère des protéines in vivo. Bien que les données présentées ont été obtenues à partir d'un récepteur membranaire spécifique (c.-à Ste2p) exprimée dans les cellules de la levure, la méthode est globale en ce qu'elle peut être appliquée à tout type de protéine exprimée dans tout type de cellule, la seule condition étant que les protéines sont éti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Initiative UW-Milwaukee recherche de croissance, l'Institut du Wisconsin pour la recherche biomédicale et des technologies de la santé, et la Fondation Bradley.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
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