スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で
Summary
スペクトル的に解決された二光子顕微鏡イメージングシステムを採用することにより、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）効率のピクセルレベルのマップは、ホモオリゴマー複合体を形成するために仮定膜受容体を発現する細胞に対して得られる。効率マップをFRETから、我々が検討されてオリゴマー複合体に関する化学量論的情報を推定することができます。
Abstract
情報が両方の利点を産業用途だけでなく、基本的な基本的な生物学的知識を高めるに蓄積されたので、生きた細胞内のタンパク質相互作用の研究は、研究の重要な領域です。電子励起状態におけるドナー分子と近隣のアクセプター分子との間のフェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動は、（FRET）頻繁に生細胞におけるタンパク質間相互作用の研究のために利用されている。興味のあるタンパク質は、蛍光プローブの2種類のタグ付けと生物細胞で発現されています。蛍光プローブは、一般的にレーザー光を使用して、励起され、蛍光プローブから発せられる蛍光発光のスペクトル特性を収集し、分析される。タンパク質相互作用の程度に関する情報は、分光放射データに埋め込まれています。一般的に、細胞を正確に細胞内で関心のある各地域のタンパク質相互作用の程度を定量化するために十分なスペクトル情報を蓄積するために、回数をスキャンする必要があります。しかし、これらの領域の分子組成は、細胞全体の平均には明らかに、FRET効率の定量的な値の空間的な決定を制限する、取得プロセスの過程で変更される可能性があります。スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いて、我々は、関心のサンプルの唯一の完全な励起のスキャン後のスペクトル解決のイメージの完全なセットを取得することができます。このピクセルレベルのスペクトルデータから、細胞全体に効率のFRETのマップが計算されます。細胞全体に効率のFRETの実験で得られた分布するオリゴマー複合体におけるFRETの単純な理論を適用することにより、単一のスペクトル解決のスキャンは、研究の下でオリゴマー複合体に関する化学量論と構造情報を明らかにする。ここでは、蛍光プローブの2種類のタグが付けられた膜の受容体（滅菌2α-因子受容体）を発現する生物細胞（ 酵母 Saccharomyces cerevisiae）の準備の手順を説明します。さらに、我々はスペクトル解決二光子顕微鏡イメージングシステムを用いて蛍光データの収集に関与する重要な要素を示しています。このプロトコルの使用はそれに接続されている蛍光マーカーと生細胞内で発現可能なタンパク質の任意のタイプを研究するために拡張することができる。
Protocol
Discussion
本発表では、我々はin vivoでのタンパク質のオリゴマー複合体についてのサイズと構造情報を決定する方法を示します。提示されたデータは、酵母細胞で発現し、特定の膜受容体（すなわちSte2p）から得ていたが、方法は、それがセルの任意のタイプで発現するタンパク質の任意の種類、その蛋白質であることのみを規定する適用可能なすべての点で網羅です適切な蛍光マーカーでタグ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、UW -ミルウォーキーの研究成長戦略大綱、生物医学と医療技術のためのウィスコンシン州研究所、そしてブラッドリー財団によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
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