В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии
Summary
Используя спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы, на уровне пикселей карты Ферстер Резонансная переноса энергии (FRET) эффективности получены для клеток, экспрессирующих рецепторы мембраны гипотеза о форме гомо-олигомерных комплексов. С FRET эффективность карты, мы можем оценить стехиометрических информацию о олигомер комплекс в стадии изучения.
Abstract
Изучение белковых взаимодействий в живых клетках является важной областью исследований, поскольку информация, накопленная как преимущества, так промышленных приложений, а также увеличивает основные фундаментальные биологические знания. Ферстер (флуоресценция) Резонансное переноса энергии (FRET) между донором молекулы в электронно-возбужденное состояние и близлежащие молекулы акцептора неоднократно использовались для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Белков, представляющих интерес, помеченные двух различных типов флуоресцентных зондов и выразил в биологических клетках. Флуоресцентных зондов возбуждаются, обычно с помощью лазерного излучения, и спектральные свойства флуоресценции выбросов, исходящих из флуоресцентных зондов собираются и анализируются. Информация о степени белковых взаимодействий встроен в спектральных данных о выбросах. Как правило, ячейки должны быть отсканированы количество раз для того, чтобы накопить достаточно спектральной информации точно количественно степень белковых взаимодействий для каждого региона интересов внутри клетки. Тем не менее, молекулярный состав этих регионах может измениться в ходе процесса приобретения, ограничивая пространственного определения количественных значений очевидно FRET эффективность в среднем по всей клетки. С помощью спектрально решен двухфотонного микроскопа, мы имеем возможность получить полный набор спектрально решен изображений после одной полной проверки возбуждения образца интересов. От этого на уровне пикселей спектральные данные, карту FRET эффективность всей клетке рассчитывается. Применяя простой теории FRET в олигомерных комплексов экспериментально полученные распределения FRET эффективности по всей клетке, одну спектрально решен сканирование показывает стехиометрических и структурную информацию о олигомер комплекс в стадии изучения. Здесь мы опишем порядок подготовки биологических клеток (CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces), выражающая мембранных рецепторов (стерильные 2 α-фактора рецепторов) с меткой двух различных типов флуоресцентных зондов. Кроме того, мы показываем критические факторы, связанные со сбором данных с помощью флуоресценции спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы. Использование этого протокола может быть продлен для изучения любого типа белка, который может быть выражен в живой клетке с флуоресцентным маркером прилагается к нему.
Protocol
Discussion
В этой презентации мы показали, как определить размер и структурную информацию о белковый комплекс олигомерных в естественных условиях. Хотя данные, представленные была получена из специфическим рецептором мембраны (т.е. Ste2p), выраженные в дрожжевые клетки, этот метод является все…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана UW-Милуоки исследований роста инициативы, Висконсин Институт медико-биологических и медицинских технологий, а также Фонда Брэдли.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Riferimenti
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
