En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía
Summary
Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.
Abstract
El estudio de las interacciones de proteínas en células vivas es un área importante de investigación debido a que la información acumulada tanto en las aplicaciones de los beneficios industriales, así como aumenta el conocimiento básico biológico fundamental. Förster (fluorescencia) la transferencia de energía por resonancia (FRET) entre una molécula de donantes en un estado electrónicamente excitado y una molécula de receptor de cerca ha sido frecuentemente utilizado para el estudio de las interacciones proteína-proteína en las células vivas. Las proteínas de interés se marcan con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes y se expresa en las células biológicas. Las sondas fluorescentes son entonces emocionado, por lo general usando luz láser, y las propiedades espectrales de la emisión de fluorescencia que emanan de las sondas fluorescentes se recopila y analiza. La información sobre el grado de las interacciones proteína está incrustado en los datos de emisión espectral. Por lo general, la célula debe ser analizado un número de veces que el fin de acumular suficiente información espectral para cuantificar con exactitud el alcance de las interacciones de proteínas por cada región de interés dentro de la célula. Sin embargo, la composición molecular de estas regiones pueden cambiar durante el curso del proceso de adquisición, lo que limita la determinación espacial de los valores cuantitativos de la aparente eficiencia de FRET a un promedio de células enteras. Por medio de un espectro resuelto de dos fotones microscopio, podemos obtener un conjunto completo de imágenes espectral resuelto después de sólo un ciclo de excitación completa de la muestra de interés. De estos datos espectrales a nivel de píxeles, un mapa de FRET eficiencia a través de la celda se calcula. Mediante la aplicación de una teoría simple de FRET en los complejos oligoméricos a la distribución obtenidos experimentalmente la eficiencia de FRET en toda la célula, una sola exploración espectral resuelto revela información estequiométrica y estructural sobre el complejo oligómero en estudio. A continuación se describe el procedimiento de preparación de las células biológicas (la levadura Saccharomyces cerevisiae) que expresan receptores de membrana (estéril factor 2 α-receptores) marcado con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes. Además, ilustran los factores críticos de la recogida de los datos de fluorescencia utilizando el espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía. El uso de este protocolo podrá ser extendido a estudiar cualquier tipo de proteína que puede ser expresado en una célula viva con un marcador fluorescente que se le atribuye.
Protocol
Discussion
En esta presentación, se muestra cómo determinar el tamaño y la información estructural de un complejo de proteínas oligómero in vivo. Aunque los datos presentados se obtuvieron de un receptor específico de membrana (es decir, Ste2p) expresado en células de levadura, el método es que todo lo abarca, ya que se puede aplicar a cualquier tipo de proteína expresada en cualquier tipo de célula, la única condición es que las proteínas están etiquetados con los marcadores fluorescentes adecuados. Futura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Universidad de Wisconsin-Milwaukee crecimiento, el Instituto de Investigación Biomédica de Wisconsin y Tecnologías de la Salud y la Fundación Bradley.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
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