Summary
व्यक्ति जीवित कोशिकाओं में डीएनए अणु की नमाज़ की एक विधि का वर्णन है. तकनीक fluorescently टैग लाख repressor बाध्यकारी हित के डीएनए में इंजीनियर साइटों के लिए प्रोटीन के बंधन पर आधारित है. इस विधि के लिए समय के साथ जीवित कोशिकाओं में कई रीकॉम्बीनैंट DNAs का पालन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
1. कोशिकाओं की दर्शनीय प्लास्मिड के साथ इंजीनियरिंग
- मानक प्रतिबंध पाचन या मुताबिक़ पुनर्संयोजन तकनीक का उपयोग करने के लिए एक डीएनए टुकड़ा कल्पना प्लाज्मिड में लैक्टोज ऑपरेटर अनुक्रम (LACO) की लगभग 250 प्रतियां युक्त परिचय. हमारे प्लाज्मिड लगभग 170 KBP की एक BACmid था और Kaposi है sarcoma-जुड़े दाद वायरस के पूरे जीनोम (KSHV) और 12 hygromycin को इनकोडिंग प्रतिरोध निहित.
- का परिचय LACO युक्त स्तनधारी कोशिकाओं में 2000 Lipofectamine साथ अभिकर्मक द्वारा प्लास्मिड डीएनए. हम 25 μl 2000 Lipofectamine, 0.5 मिलीलीटर OptiMEM, और 3.5 मिलीलीटर DMEM के साथ 10 ग्राम शुद्ध प्लास्मिड डीएनए के साथ 4 घंटे के लिए 60 मिमी व्यंजन में HELA और एसएलके कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट.
- 5 मिलीलीटर DMEM 10% 48 घंटा के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम और सेते कोशिकाओं के साथ संस्कृति के माध्यम बदलें.
- प्लेट बड़े बर्तन और मध्यम में संस्कृति शुरू की पीएलए के लिए एक एंटीबायोटिक चयन युक्त कोशिकाओं में कम घनत्व कोशिकाओंSMID, हम DMEM में 3 सप्ताह के लिए 300 छ / मिलीलीटर hygromycin के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ कोशिकाओं को चुना.
- बाँझ, trypsin लथपथ फिल्टर पेपर के टुकड़े का उपयोग करने के लिए नई संस्कृति व्यंजन hygromycin प्रतिरोधी कालोनियों के हस्तांतरण.
- जब ट्रांसफ़ेक्ट क्लोनों थाली भर के लिए हो गए हैं, प्रतिबंध पाचन के लिए डीएनए को अलग करने के लिए और करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्लाज्मिड LACO की बहुलक समरूप है और उम्मीद आकार के सोख्ता दक्षिणी.
- यदि प्लाज्मिड Laci की एक संलयन व्यक्त नहीं किया गया इंजीनियर है, तो एक retrovirus एन्कोडिंग repressor लैक्टोज (Laci) Laci tdTomato के रूप में इस तरह के एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से इनकार के साथ उपयुक्त क्लोनों को संक्रमित. हम बजाय tdTomato प्रोटीन है कि हरे रंग के लिए है कि लंबे समय के 13 से अधिक बार कई जोखिम से घटित होता photoxicity को कम करने के लिए करीब प्रतिदीप्ति का उपयोग करें.
- एक बार Laci संलयन प्रोटीन शुरू की है, संस्कृति 200 छ / मिलीलीटर isopropyl BD-thiogalactoside (IPTG) बंधन से संलयन प्रोटीन ब्लॉक की उपस्थिति में कोशिकाओंडीएनए.
- संस्कृति कम से कम 3 दिनों के लिए कोशिकाओं प्रोटीन Laci tdTomato की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए.
- कि अबाध संलयन प्रोटीन के न्यूनतम स्तर पृष्ठभूमि के साथ अलग संकेत प्रकट Laci tdTomato का इष्टतम स्तर के साथ उन लोगों के लिए स्क्रीन क्लोन (दूर IPTG धोने और कोशिकाओं को देखने के रूप में नीचे वर्णित).
2. इमेजिंग प्रणाली का विकास
हमारे इमेजिंग प्रणाली एक Zeiss Axiovert 200M एक motorized मंच और योजना Aochromat 63x/1.4 तेल उद्देश्य के साथ सुसज्जित होते हैं. प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रकाश "तटस्थ सफेद" एक Colibri प्रणाली के नेतृत्व द्वारा प्रदान की जाती है. उत्सर्जन एक CascadeII द्वारा पता चला है: 1024 EMCCD कैमरे. यह एक ठंडा, amplifying संकेतों के लिए एक लाभ रजिस्टर के साथ वापस thinned कैमरा है, अंधेरे वर्तमान प्रति सेकंड पिक्सेल प्रति 0.061 इलेक्ट्रॉनों है, और क्वांटम दक्षता 0.90 से अधिक है. प्रणाली मॉड्यूल सहित SmartExperiments, AxioVision 4.8 सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. TdToma का पता लगाने के लिएहम एक Zeiss फिल्टर सेट 75HE उपयोग जिसके लिए पारित प्रकाश की 85% स्त्राव उत्तेजित कर सकते हैं और उत्सर्जित प्रकाश की 95% उत्सर्जन फिल्टर पारित करेंगे.
- एक औंधा और संकेतों के संवेदनशील पता लगाने, विशिष्ट उत्तेजना और तेजी से shuttering, एक motorized मंच और ध्यान के हाथ के लिए एक एलईडी प्रकाश स्रोत और छवियों के स्वचालित अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर नियंत्रण के लिए एक EMCCD कैमरे खुर्दबीन के साथ साथ कई लंबे समय अंतराल पर एक इमेजिंग प्रणाली को इकट्ठा z-ढेर. प्रणाली एक हवा के कंपन से अलग किया जा मेज पर बैठना चाहिए.
- एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर इकट्ठे करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, एक humidified कक्ष में 5-10% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए. एक स्थिर तापमान में आने के लिए प्रयोग के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए इस प्रणाली के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें.
- नमूना से गर्मी वसूलना से उद्देश्य को रोकने के उद्देश्य के लिए एक गर्म कॉलर का प्रयोग करें.
3. लेबल वाले डीएनए के दृश्य
- एक 35 मिमी प्लेट कोशिकाओंकम से कम 10% के संगम की एक घनत्व पर पकवान गिलास नीचे है, जो कोशिकाओं के जोड़े 8-16 कोशिकाओं की कालोनियों में अतिव्यापी बिना विभाजित करने की अनुमति देगा. इमेजिंग यह कम से कम 24-48 घंटे से पहले ऐसा करने के है कि व्यवहार्य कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए समय है.
- इमेजिंग के शुरू होने से पहले एक से तीन घंटा, थाली मध्यम संस्कृति है जो दोनों चयनात्मक दवाओं और IPTG का अभाव के साथ 3 बार कुल्ला. इस प्रक्रिया दूर washes अलाभकारी कोशिकाओं और Laci संलयन प्रोटीन plasmids में LACO साइटों को बाध्य करने के लिए अनुमति देता है.
- 2 मिलीलीटर DMEM के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 25 मिमी HEPES के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें.
- संस्कृति पकवान की CultFoil साथ शीर्ष बदलें एक 35 मिमी पकवान के लिए एक बढ़ते अंगूठी में बढ़ाकर. इस कवर संस्कृति के माध्यम है, जो समय के साथ नमक एकाग्रता बढ़ाने के लिए और कोशिकाओं को मारने के वाष्पीकरण को बाधित करेगा.
- अंतर हस्तक्षेप विपरीत इमेजिंग (डीआईसी) का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को देखने और शीर्ष और देखने के कई क्षेत्रों में कोशिकाओं के नीचे के फोकल हवाई जहाज़ का निर्धारण.प्रत्येक क्षेत्र में, सेल के ऊपर से एक नाभीय विमान लगभग 1/3 रास्ते से नीचे ले जाता है. X सहेजें, वाई, जेड बचाया मंच पदों की सूची में समन्वय.
नोट: प्लास्मिड संकेतों eyepieces जब कोशिकाओं Laci संलयन प्रोटीन के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के एल ई डी द्वारा प्रकाशित कर रहे हैं के माध्यम से दिखाई नहीं हो सकता. कमजोर संकेतों EMCCD कैमरा है, जो समय के साथ संकेत के एकीकरण की अनुमति देता है और इस प्रकार प्रभावी रूप से कमजोर संकेतों amplifies के उपयोग के साथ ही दिखाई दे सकता है. - खुर्दबीन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रत्येक बचाया स्थिति चरण पर प्रदर्शन किया छवियों के z ढेर को परिभाषित. Az 0.35-0.50 सुक्ष्ममापी कदम आकार चुनें, जो आप z आयाम 14 में लगभग Nyquist नमूना करने की अनुमति देगा. ऊपर विमानों और नीचे में जो कोशिकाओं स्थित हैं "अतिरिक्त" स्लाइस में शामिल हैं, इन स्लाइस कोशिका चक्र के दौरान सेल के आंदोलनों के बाद पता लगाने की अनुमति है, और भी छवि के ढेर के प्रसंस्करण के बाद अधिग्रहण (deconvolution) में इस्तेमाल किया. यह शामिल किए जाने40-60 छवियों के एक ढेर में परिणाम, कोशिकाओं की मोटाई पर निर्भर करता है.
- माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एक समय श्रृंखला प्रयोग को परिभाषित करने के लिए 30 मिनट (लंबे समय से कोशिका विभाजन और migrations पर नज़र रखने के लिए) और 10-60 मिनट के अंतराल पर अंतराल प्रतिदीप्ति छवियों पर z के ढेर के उज्ज्वल क्षेत्र छवि एकत्र (plasmids दृश्यमान करने के लिए कोशिकाओं के भीतर). प्रयोग के दौरान उपयोग डीआईसी इमेजिंग नहीं है, के रूप में इसे और अधिक मानक उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग, जो कोशिकाओं अनावश्यक लंबे प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर बेनकाब phototoxicity से प्रकाश की आवश्यकता है.
- सॉफ्टवेयर नियंत्रित प्रयोग शुरू करें. सुनिश्चित करें कि सिस्टम (टकरा, अतिरिक्त कमरा प्रकाश, आदि के लिए संपर्क में) प्रयोग के दौरान परेशान नहीं है.
- यदि आवश्यक हो, प्रयोग के दौरान humidification प्रणाली में पानी भरने के लिए.
4. छवियाँ के प्रसंस्करण के बाद अधिग्रहण
- प्रत्येक Z-ढेर समय बिंदु के लिए छवियों की समीक्षा करें. बाहर किसी भी unneeded के क्षेत्रों फसलअगले कदम में कंप्यूटर प्रसंस्करण समय कम छवियाँ.
- एक deconvolution एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए प्रत्येक 15 z ढेर में मूल के पिक्सेल संकेत तीव्रता असाइन. हालांकि इस deconvolution अपने इमेजिंग प्रणाली के लिए एक सैद्धांतिक बात फैल समारोह पर आधारित हो सकता है, यह बेहतर है इमेजिंग फ्लोरोसेंट microspheres द्वारा अपने विशेष प्रणाली की बात फैल समारोह को मापने, और deconvolution एल्गोरिथ्म में इस माप का उपयोग. हम हमारे इमेजिंग प्रणाली की बात फैल समारोह मापा और लागू एक विवश AxioVision सॉफ्टवेयर (AxioVision सॉफ्टवेयर विवरण, Zeiss) में अधिकतम संभावना एल्गोरिथ्म चलने का.
- छवियों जांच तीव्रता परिवर्तन और plasmids के आंदोलनों और सेल चक्र के दौरान बेटी की कोशिकाओं के लिए plasmids के विभाजन को ट्रैक.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Z-ढेर एक प्रतिनिधि प्रयोग में अधिग्रहण की अधिकतम तीव्रता अनुमानों 3 चित्र में दिखाया जाता है. ठेठ प्लाज्मिड संकेतों पर निर्भर करता है कि क्या वे एक या plasmids के समूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, Z-ढेर के 3-8 स्लाइस में मौजूद हैं. EBV से और KSHV व्युत्पन्न plasmids के मामले में, संकेत कोशिका के भीतर धीरे धीरे कदम जब तक सेल पिंजरे का बँटवारा तक पहुँचता है. कोशिकाओं को खुद पर प्रयोग के दौरान विस्थापित. उन्होंने यह भी गोलाकार हो जाते हैं और पिंजरे का बँटवारा दौरान पकवान से अलग है. स्वस्थ HELA और एसएलके कोशिकाओं के लिए सेल चक्र लगभग 24 घंटा लगता है, कि कोशिका चक्र को पूरा करने के लिए 30 से अधिक घंटा ले इन प्रकार की कोशिकाओं अस्वस्थ विचार किया जाना चाहिए. बेटी की कोशिकाओं को आम तौर पर एक दूसरे के निकट देते हैं और पर जाने के लिए अगले सेल चक्र में एक ही समय में विभाजित है. केवल कोशिकाओं है कि एक कोशिका चक्र को पूरा करने के लिए दिखाया जा सकता है विश्लेषण किया जाना चाहिए.
"Alt =" 05/4305fig1.jpg चित्रा 1 "/>
चित्रा 1 plasmids दिखाई बनाने के लिए योजना. (ए) लैक्टोज ऑपरेटर अनुक्रम (LACO) की अग्रानुक्रम दोहराता ब्याज की प्लाज्मिड में क्लोन कर रहे हैं. लैक्टोज repressor प्रोटीन (Laci) इन दृश्यों के लिए विशेष रूप से बांध, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन ब्याज के प्लाज्मिड फ्लोरोसेंट टैग रंगरूटों. (ख और ग) एक HeLa Laci tdTomato व्यक्त सेल के नाभिक फ्लोरोसेंट संलयन यह नाभिक स्थानीयकृत प्रोटीन पर परमाणु स्थानीयकरण संकेत के कारण है. KSHV LACO दृश्यों एन्कोडिंग जीनोम फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कई प्रतियां भर्ती और IPTG (बी) के अभाव में नाभिक की पृष्ठभूमि तीव्रता पर उज्ज्वल संकेत के रूप में बाहर खड़े हैं, जबकि Laci फ्लोरोसेंट प्रोटीन में इसकी मान्यता LACO अनुक्रम करने के लिए बाध्य करने के लिए रोका जाता है IPTG (सी) की उपस्थिति. इन छवियों computationally कई z विमानों जिसमें विभिन्न संकेतों रहते शामिल करने के लिए बना रहे हैं.
चित्रा 2 प्लाज्मिड दृश्य प्रक्रिया का आरेख. सबसे पहले, अग्रानुक्रम LACO दोहराता ब्याज की प्लाज्मिड में क्लोन कर रहे हैं. यही प्लाज्मिड कोशिकाओं में अभिकर्मक द्वारा शुरू की है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के क्लोन का चयन कर रहे हैं और जांच की, और फिर एक एक फ्लोरोसेंट Laci संलयन प्रोटीन व्यक्त retrovirus से संक्रमित है.
चित्रा 3 छवियों समीक्षा plasmids सेल चक्र के दौरान ट्रैक. Fluorescently टैग एक HeLa सेल (A) में वायरल जीनोम चरण एस (बी) में संश्लेषित कर रहे हैं और कोशिका विभाजन (सीई) के दौरान बेटी की कोशिकाओं को विभाजित और कई पीढ़ियों के लिए पीछा किया जा सकता है. दिखाया z के ढेर की अधिकतम तीव्रता अनुमानों पाँच समय बिंदुओं पर एक HeLa सेल चक्र का एक प्रतिनिधि प्रयोग में हासिल. इन छवियों चित्रा 1 बी और सी के रूप में बना रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित विधि कई पीढ़ियों फैले समय पर जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में plasmids का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्तेजना प्रकाश करने के लिए जोखिम को सीमित करके, हम इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है 16-32 कोशिकाओं की कालोनियों के माध्यम से नव विभाजित जोड़े से कोशिकाओं का पालन करने के लिए, कम से कम 72 घंटे और 3 सेल डिवीजनों का प्रतिनिधित्व. इन प्रयोगों जानकारी है कि मात्रात्मक पीसीआर, सोख्ता दक्षिणी, और मछली जैसे स्थिर assays से प्राप्त नहीं किया जा प्रदान करते हैं.
यह जरूरी है एक समरूप संरचना के साथ plasmids के लिए कोशिकाओं के क्लोन स्क्रीन है, के रूप में rearrangements जब अग्रानुक्रम LACO दोहराता रूप में दोहराव दृश्यों के साथ plasmids का उपयोग हो सकता है. इसके अलावा, यह एक इष्टतम संकेत तीव्रता के लिए retrovirus संक्रमण और संक्रमित कोशिकाओं की स्क्रीन क्लोन का अनुकूलन के लिए उपयोगी है. बहुत ज्यादा Laci प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के नाभिक में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, और बहुत कम व्यक्त उन कमजोर संकेतों होगा. अंत में, मैं इसेएस सेल आकारिकी पर देखने के लिए महत्वपूर्ण है और स्वस्थ कोशिकाओं का चयन जब देखने के क्षेत्र अंकन उनके दृश्य के दौरान उपयोग.
इस तकनीक के लिए लगभग किसी भी डीएनए अणु कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते वह LACO अनुक्रम का अग्रानुक्रम दोहराता शामिल इंजीनियर हो सकता है. उदाहरण सेलुलर गुणसूत्रों, स्वाभाविक रूप से होती है और कृत्रिम plasmids, और वायरल जीनोम virions भीतर पैक शामिल हैं. 3 चित्र में दिखाया गया है कि इसी तरह के प्रयोगों में, हमने पाया है कि हमारे KSHV व्युत्पन्न plasmids बेतरतीब ढंग से कोशिका विभाजन के दौरान विभाजित किया जा दिखाई देते हैं. तकनीक का एक तार्किक विस्तार करने के लिए एक जोड़ी / LACO Laci के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और एक टेट्रासाइक्लिन ऑपरेटर / अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ Tetetracycline repressor जोड़ी के रूप में एक ही सेल में एक डीएनए अणु के साथ एक डीएनए अणु टैग है. प्रयोगों उत्तेजना प्रकाश की राशि कोशिकाओं साइटोटोक्सिक प्रभावों का सामना करने से पहले का सामना कर सकते हैं द्वारा सीमित हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH और ACS, T32CA009135 सहित, CA133027, CA070723, और CA022443 से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. विधेयक सागडेन एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च प्रोफेसर है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
