RNA<em在原位</em>改编为海洋软骨鱼类杂交整装胚胎发育和细胞组织学
Summary
通过RNA整装相结合的方法<em在原位</em>杂交和组织学，基因表达可在胚胎发育与细胞命运的决定。这些方法已经适应了海洋软骨鱼类和方便的使用这些动物作为生物医学，毒物学和比较研究的模式生物。
Abstract
海洋软骨鱼类生物医学和基因组学研究的动物模型的价值，因为他们是最原始的脊椎动物适应性免疫，并有独特的渗透调节机制为1-3。作为最原始的生活有颚脊椎动物与配对的附属物，软骨鱼类进化是一个重要的模型，特别是在进化和发展的研究。海洋软骨鱼类也被用于研究水生生物毒理学和逆境生理关系，气候变化4。因此，发展和适应的方法是必要的，以促进和扩大利用这些原始的脊椎动物多个生物学科。在这里，我成功适应的RNA整个安装在原位杂交和组织学技术在软骨鱼类的基因表达和细胞组织学研究。
监测基因表达的特点是发育生物学工具学家，被广泛用于研究发育过程。 RNA 原位杂交，使发育中的胚胎组织中的特定基因转录的可视化和本地化。能够洞察发育过程中细胞命运决定基因可以控制基因的表达模式的消息。通过比较在不同发育阶段的基因的表达模式，洞察可以得到如何在开发过程中的作用的一个基因的改变。
虽然整个安装在原位的提 供了一种基因表达的本地化组织，组织学技术允许分化的细胞类型和组织的鉴定。组织学污渍有不同的功能。一般污渍是用来突出，例如细胞形态的细胞核和细胞质对于一般性的染色，苏木精和曙红。其他污渍可以突出显示特定的细胞类型。例如，阿辛蓝染色本文报道的是一种广泛使用的阳离子染色，以确定mucosaccharides。阿尔新蓝染色，消化道可以识别分布杯状细胞产生mucosaccharides的的。短肽mucosaccharide成分变化区分杯状细胞的功能，消化道内的6。同时通过RNA安装在原位的组织化学方法，细胞命运的决定可以被链接到特定基因的表达。
虽然RNA 原位的组织化学的研究人员，他们的适应和利用海洋软骨鱼类被广泛应用于满足有限的，不同程度的成功。在这里，我提出的软骨鱼类和开发，在我的实验室定期使用的协议。虽然可能需要进一步的变形例中的RNA 原位的杂交方法，以适应不同的物种，这里描述的协议p海洋软骨鱼类的使用要适应他们的科学调查的研究人员开展交流一个有力抓手。
Protocol
一，RNA 原位杂交技术在全山海洋软骨鱼类 1。胚胎的固定和准备滑板胚胎可以上演根据巴拉德7。用于检测基因表达的最优性阶段取决于感兴趣的组织。为了跟踪基因的表达在滑板消化道，阶段27-30是最佳7。 解剖胚胎PBS，分离胚胎的卵黄囊。 修正在30毫升新鲜配制的4％多聚甲醛（PFA）的50毫升锥形管中，在4℃用温和的摇摆。修?…
Representative Results
在不同地区的L.阿尔新蓝染色的例子在图2中所示erinacea消化道。酸的粘蛋白含有globlet细胞是清晰可见整个消化道的阿辛蓝染色。酸粘蛋白的分布不同，在消化道的不同区域，从而反映出在功能上的差异。酸性的粘蛋白在螺旋小肠和泄殖腔稀疏产生的，而在远侧小肠（比较图2a和 2c与2b中 ）检测到高浓度的酸粘蛋白。 <table border="1" fo:keep-together….
Discussion
的协议是典型的监测基因表达的方法，并确定分化的细胞类型，并已被改编为海洋软骨鱼类。这些协议可能需要进一步的修改，以适应不同的软骨鱼物种。
最常见的关切RNA整装原位的是RNase的污染的风险，从而降解的RNA探针和内源性消息。需要考虑两个方面：合成的核糖体探针和杂交胚胎邮件，和一般的技术处理RNA。在一般情况下，由核糖核酸酶的污染可避免从容器未…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我想感谢许多本科学生在我的实验室工作，并为此作出了贡献，这些协议的演变。 NAT支持斯基德莫尔联盟网络，建立项目与美国国家科学基金会预先支付的补助金。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Theodosiou, N. A. RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs. J. Vis. Exp. (74), e50165, doi:10.3791/50165 (2013).