רנ"א<em> באתר</em> הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי
Summary
על ידי שילוב של כל שיטות להר רנ"א<em> באתר</em> הכלאה והיסטולוגיה, ביטוי גנים יכולים להיות מקושרת עם החלטות גורל תא בעובר המתפתח. שיטות אלו הותאמו לelasmobranchs הימי ולהקל על השימוש בבעלי החיים אלה כאורגניזמים מודל למחקרים ביו, רעלים והשוואתיים.
Abstract
elasmobranchs הימי מוערכים מודלים של בעלי חיים למחקרים ביו וגנומית כפי שהם החוליות הפרימיטיביות ביותר שיש חסינות אדפטיבית ויש מנגנונים ייחודיים לויסות לחץ האוסמוטי 1-3. כאמן חוליות לסת החיים הפרימיטיביים ביותר עם ספיחים לזווג, elasmobranchs הוא מודל אבולוציונית חשוב, במיוחד ללימודים באבולוציה ובהתפתחות. elasmobranchs הימי יש גם שמש ללמוד טוקסיקולוגיה הימית ופיזיולוגיה של לחץ במערכת יחסים עד 4 שינויי האקלים. לפיכך, פיתוח וההתאמה של מתודולוגיות נדרשים כדי להקל ולהרחיב את השימוש בחוליות הפרימיטיביות האלה לתחומים ביולוגיים רבים. כאן אני מציג את ההסתגלות המוצלחת של כל הר רנ"א כלאה באתר וטכניקות היסטולוגית ללמוד ביטוי גנים והיסטולוגיה תא בelasmobranchs.
ניטור ביטוי גנים הוא כלי היכר של Biol התפתחותיתogists, ונמצא בשימוש נרחב כדי לחקור תהליכים התפתחותיים 5. כל הר רנ"א כלאה באתר מאפשר להדמיה והלוקליזציה של תעתיקי גנים ספציפיים ברקמות של העובר המתפתח. דפוס הביטוי של המסר של גן יכול לספק תובנה לגבי מה תהליכים התפתחותיים והחלטות גורל תא גן יכולים לשלוט. על ידי השוואת דפוס הביטוי של גן בשלבי התפתחות שונים, תובנה ניתן להשיג בכמה תפקידים של שינויים גנטיים במהלך התפתחות.
בעוד כל ההר באתר של מספק אמצעים לאיתור ביטוי גנים ברקמות, טכניקות היסטולוגית תאפשרנה זיהוי של סוגי תאים מובחנים ורקמות. כתמי היסטולוגית יש פונקציות מגוונות. כתמים כלליים משמשים כדי להדגיש מורפולוגיה של תאים, למשל hematoxylin וeosin לצביעה כללית של גרעינים וציטופלסמה, בהתאמה. כתמים אחרים יכולים לסמן תאים ספציפייםסוגים. לדוגמה, alcian כתם הכחול דיווח במאמר זה הוא בשימוש נרחב כתם קטיוני לזהות mucosaccharides. הכתמה של מערכת העיכול עם alcian כחול יכולה לזהות את חלוקת תאי גביע המייצרים mucosaccharides. שינויים במרכיבי mucosaccharide על פפטידים קצרים להבחין תאי גביע בתפקידו במסגרת מערכת העיכול 6. באמצעות כל הר RNA בשל אתרו וhistochemical שיטות בו זמנית, החלטות גורל תא יכולות להיות מקושרות לביטוי גנים ספציפיים.
אמנם RNA בים וhistochemistry "אתר נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים, ההסתגלות והשימוש בם בelasmobranchs הימי נפגשו הצלחה מוגבלת ומגוונת. כאן אני מציג את הפרוטוקולים שפותח עבור elasmobranchs והשתמשו על בסיס קבוע במעבדה שלי. למרות שינויים נוספים של RNA בשיטת הכלאה של אתר עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למינים שונים, הפרוטוקולים מתוארים כאן עמrovide נקודת התחלה חזקה עבור חוקרים המבקשים להתאים את השימוש בelasmobranchs הימי לשאלות המדעיות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים שהוצגו הם שיטות קלסיות לניטור ביטוי גנים וזיהוי סוגי תאים מובחנים, והותאמו לשימוש בelasmobranchs הימי. שינויים נוספים של פרוטוקולים אלה עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למיני elasmobranch שונים.
הדאגה הנפוצה ביותר לגבי כל הר רנ"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני רוצה להודות לסטודנטים לתואר הראשון הרבים שעבדו במעבדה שלי ותרמו להתפתחות של פרוטוקולים אלה. NAT קבל תמיכה מסקידמור-איחוד הרשת, פרויקט שהוקם עם ADVANCE NSF שולם מענק.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
Riferimenti
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
