RNA<em> In situ</em> Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst
Summary
Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole mount<em> In situ</em> Hybridisierung und Histologie, die Genexpression mit Zellschicksals Entscheidungen in den sich entwickelnden Embryo verknüpft werden. Diese Methoden haben, um marine Elasmobranchien angepasst und erleichtern die Verwendung dieser Tiere als Modellorganismen für die biomedizinische, Toxikologie und vergleichende Studien.
Abstract
Marine-Elasmobranchien sind Tiermodelle für die biomedizinische und genomische Studien bewertet, wie sie die primitivsten Wirbeltiere adaptive Immunität und haben einzigartige Mechanismen zur Osmoregulation 1-3 sind. Da die primitivsten lebenden jawed-Wirbeltiere mit gepaart Anhängsel sind Elasmobranchien ein evolutionär wichtiges Modell, vor allem für Studien in der Evolution und Entwicklung. Marine-Elasmobranchien sind auch verwendet worden, um aquatische Toxikologie und Streßphysiologie im Verhältnis zum Klimawandel 4 studieren. So wird die Entwicklung und Anpassung von Methoden benötigt, um zu erleichtern und erweitern den Einsatz dieser primitiven Wirbeltieren zu mehreren biologischen Disziplinen. Hier präsentiere ich die erfolgreiche Anpassung der RNA whole mount in situ Hybridisierung und histologische Techniken, um die Genexpression und Histologie in Elasmobranchien studieren.
Monitoring der Genexpression ist ein Markenzeichen Tool von Entwicklungsstörungen biologists, und häufig verwendet, um zu untersuchen Entwicklungsprozesse 5. RNA whole mount in situ Hybridisierung ermöglicht die Visualisierung und Lokalisierung von spezifischen Gen-Transkripte in Geweben des sich entwickelnden Embryo. Das Expressionsmuster eines Genes kann die Nachricht Einblick in Entwicklungsprozessen und Zellschicksals Entscheidungen ein Gen kann zu steuern. Durch den Vergleich der Expression eines Gens in verschiedenen Entwicklungsstadien, können Einblick in die Rolle eines Gens Veränderungen während der Entwicklung gewonnen werden.
Während whole mount in situ "s stellt ein Mittel zum Lokalisieren von Gewebe Genexpression erlauben histologische Techniken zur Identifizierung der differenzierten Zelltypen und Geweben. Histologischen Färbungen haben unterschiedliche Funktionen. Allgemeine Flecken verwendet werden, um die Zellmorphologie zu markieren, z. B. Hämatoxylin und Eosin für allgemeine Färbung der Kerne und Cytoplasma sind. Andere Flecken markieren bestimmte ZelleTypen. Zum Beispiel die Alcianblau in dieser Veroffentlichung Fleck ist eine weit verbreitete kationische Fleck auf mucosaccharides identifizieren. Färbung des Verdauungstraktes mit Alcianblau identifizieren kann die Verteilung der Becherzellen, die mucosaccharides produzieren. Variationen in mucosaccharide Bestandteile auf kurze Peptide unterscheiden Becherzellen nach der Funktion im Verdauungstrakt 6. Durch die Verwendung von RNA whole mount in situ 's und histochemische Methoden gleichzeitig kann das Schicksal der Zelle Entscheidungen Gen-Expression verknüpft werden.
Obwohl RNA in situ 's und Histochemie weit von den Forschern verwendet werden, haben ihre Anpassung und Nutzung in marine Elasmobranchien begrenzt und abwechslungsreiche Erfolg. Hier präsentiere ich Protokolle für Elasmobranchien entwickelt und regelmäßig in meinem Labor. Obwohl weitere Modifikation der RNA in situ 's Hybridisierungsverfahren erforderlich sein, um an verschiedene Arten angepasst werden, die beschriebenen Protokolle hier S.rovide ein guter Ausgangspunkt für die Forscher, die die Nutzung der Meeresressourcen Elasmobranchien ihre wissenschaftliche Untersuchungen anzupassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Protokolle vorgestellt werden sind klassische Methoden zur Überwachung der Genexpression und Identifizierung differenzierte Zelltypen und wurden für den Einsatz in marinen Elasmobranchien angepasst. Weitere Modifikationen dieser Protokolle erforderlich sein, um an verschiedene Arten Knorpelfischarten anzupassen.
Die häufigste Besorgnis hinsichtlich RNA whole mount in situ "s die Gefahr der Kontamination RNase und dadurch die Degradation der RNA-Sonde und endogenen Nachri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich möchte die vielen Studenten, die in meinem Labor gearbeitet haben und dazu beigetragen, die Entwicklung dieser Protokolle danken. NAT wird unterstützt von der Skidmore-Union Network, ein Projekt mit einem NSF Voraus bezahlt Gewährung eingeräumt werden.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
Riferimenti
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