ARN<em> In situ</emHibridación> Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos
Summary
Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN total<em> In situ</emHibridación> y la histología, la expresión génica se puede vincular con las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Estos métodos han sido adaptados a los elasmobranquios marinos y facilitar el uso de estos animales como organismos modelo para estudios biomédicos, toxicología y comparativa.
Abstract
Elasmobranquios marinos se valoran los modelos animales para estudios biomédicos y genómicos, ya que son los vertebrados más primitivos para tener inmunidad adaptativa y contar con mecanismos únicos para la osmorregulación 1-3. Como las más primitivas de vida jawed vertebrados con apéndices pares, los elasmobranquios son un modelo evolutivo importante, especialmente para los estudios de evolución y desarrollo. Elasmobranquios marinos también se han utilizado para estudiar toxicología acuática y la fisiología del estrés en relación a 4 sobre el cambio climático. Así, el desarrollo y la adaptación de las metodologías que se necesita para facilitar y ampliar el uso de estos vertebrados primitivos a múltiples disciplinas biológicas. Aquí os presento la exitosa adaptación de montaje ARN total hibridación di situ y técnicas histológicas para el estudio de la expresión génica y la histología de células en los elasmobranquios.
Seguimiento de la expresión de genes es una herramienta de sello de desarrollo biologists, y se utiliza ampliamente para investigar los procesos de desarrollo 5. Montaje ARN toda la hibridación in situ permite la visualización y localización de transcritos de genes específicos en tejidos del embrión en desarrollo. El patrón de expresión del mensaje de un gen puede dar una idea de lo que los procesos de desarrollo y las decisiones de destino celular de un gen puede controlar. Al comparar el patrón de expresión de un gen en diferentes etapas de desarrollo, la visión puede ser adquirida en cómo el papel de algunos cambios genéticos durante el desarrollo.
Mientras que todo el montaje in situ 's proporciona un medio para localizar la expresión de genes a los tejidos, las técnicas histológicas permiten la identificación de tipos de células diferenciadas y tejidos. Tinciones histológicas tienen diversas funciones. Manchas generales se usan para resaltar la morfología celular, por ejemplo hematoxilina y eosina para la tinción general de núcleos y el citoplasma, respectivamente. Otras manchas pueden destacar celda específicatipos. Por ejemplo, el azul Alcian mancha presentado en este artículo es una mancha muy utilizado para identificar mucosaccharides catiónico. La tinción del tracto digestivo con azul alcián puede identificar la distribución de las células caliciformes que producen mucosaccharides. Las variaciones en los componentes mucosaccharide en péptidos cortos distinguir las células caliciformes por su función en el tracto digestivo 6. Mediante el uso de montaje ARN entero en métodos in situ 's e histoquímicas simultáneamente, las decisiones de destino celular puede estar vinculado a genes específicos de expresión.
A pesar de ARN in situ 's e histoquímica son ampliamente utilizados por los investigadores, su adaptación y uso en los elasmobranquios marinos han tenido un éxito limitado y variados. Aquí presento protocolos desarrollados para los elasmobranquios y se utiliza de forma regular en mi laboratorio. Aunque la modificación de los ARN en el método de hibridación in situ 's puede ser necesario para adaptarse a las diferentes especies, los protocolos descritos aquí proveer un sólido punto de partida para los investigadores que deseen adaptar el uso de elasmobranquios marinos para sus investigaciones científicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos presentados son métodos clásicos para el seguimiento de la expresión génica y la identificación de tipos de células diferenciadas, y se han adaptado para su uso en los elasmobranquios marinos. Las modificaciones adicionales de estos protocolos puede ser necesaria para adaptarse a las diferentes especies de elasmobranquios.
La preocupación más común con respecto montaje ARN total in situ 's es el riesgo de contaminación de ARNasa y de ese modo la degradac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Me gustaría dar las gracias a los muchos estudiantes universitarios que han trabajado en mi laboratorio y ha contribuido a la evolución de estos protocolos. NAT ha recibido el apoyo de la Red de Skidmore-Union, un proyecto creado con un avance NSF PAGADO subvención.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
Riferimenti
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