RNAを<em>その場</emホールマウント胚および細胞組織学で>ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した
Summary
RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、<em>その場で</em>ハイブリダイゼーションおよび組織学は、遺伝子発現は、発生中の胚での細胞運命決定とリンクすることができます。これらの方法は、軟骨魚類、海洋に適応し、生物医学、毒物学と比較研究のモデル生物として、これらの動物の使用を容易にされてきた。
Abstract
彼らは適応免疫を持っていると浸透圧調節1-3ユニークなメカニズムを持っている最も原始的な脊椎動物であるため海洋軟骨魚類は、生物医学やゲノム研究のための動物モデルを高く評価しています。ペアリング付属で最も原始的な有顎脊椎動物 – として、軟骨魚類は特に進化と発展の研究のために、進化的に重要なモデルです。海洋軟骨魚類はまた、気候変動4との関係における、水生毒性とストレス生理学を研究するために使用されてきた。このように、方法論の開発と適応は、複数の生物学的分野にこれらの原始脊椎動物の使用を容易にし、拡大するために必要とされる。ここで私は、in situハイブリダイゼーションおよび軟骨魚類における遺伝子発現と細胞組織学を研究する組織学的技術で RNA全体のマウントの良好な適応を示す。
遺伝子発現を監視することは発達BIOLの顕著なツールですogists、広く発達過程5を調査するために使用されています。 in situハイブリダイゼーション 、RNA全体のマウントは、発生中の胚の組織における特定の遺伝子の転写産物の可視化およびローカライズすることができます。遺伝子のメッセージの発現パターンは、遺伝子が制御してもよいものを発達過程と細胞の運命決定への洞察を提供することができます。異なる発達段階での遺伝子の発現パターンを比較することで、洞察力は開発中の遺伝子の変化をどのように役割に得ることができる。
現場の中で全体のマウントは、組織に遺伝子発現をローカライズするための手段を提供していますが、組織学的技術は、分化した細胞の種類や組織の識別を可能にする。組織学的染色は、様々な機能を持っています。一般的な汚れはそれぞれ、核と細胞質の染色のための一般的な例では、ヘマトキシリンとエオシンのために、細胞の形態を強調するために使用されています。その他の汚れは、特定のセルを強調表示することができますタイプ。たとえば、この論文で報告されているアルシアンブルー染色はmucosaccharidesを識別するために広く使われている染色カチオン性である。アルシアンブルーで、消化管の染色はmucosaccharidesを生成杯細胞の分布を識別することができます。短いペプチドでmucosaccharide成分の変動は、消化管6内に関数では杯細胞を区別する。 その場 'sと同時に組織化学的方法で RNA全体のマウントを使用することにより、細胞の運命決定は、遺伝子特異的発現にリンクすることができます。
RNAはその場 'sと組織化学で広く研究者によって使用されているが、海洋軟骨魚類での適応と使用が限られており、様々な成功を達成しました。ここで私は軟骨魚類のために開発され、私の研究室で定期的に使用されるプロトコルを提示します。 その場でのハイブリダイゼーション法における RNAのさらなる改変が異なる種に適応するために必要であるかもしれませんが、プロトコルはここでpを説明その科学的な問い合わせに海洋軟骨魚類の使用を適応したい研究者のための強力な出発点をrovide。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、遺伝子発現をモニターし、分化した細胞型を同定するための古典的な方法である、海洋軟骨魚類での使用に適合されています。これらのプロトコルのさらなる修正が異なる軟骨魚類の種に適応するために必要であるかもしれません。
現場の中の RNA全体のマウントに関する最も一般的な懸念は、RNaseのコンタミネーションのリスク?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私は私の研究室で働いており、これらのプロトコルの進化に貢献してきた多くの学部学生に感謝したいと思います。 NATはスキッドモア·ユニオン·ネットワーク、助成金を支払ったNSFの進歩により確立されたプロジェクトからの支持を受けています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
Riferimenti
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