Summary
אנו מתארים מודלים של פגיעה בכליות הנגרמות איסכמיה reperfusion בינוניות וקשות שבו העכברים עוברים הידוק חד צדדי ואחרי כריתת כליה הנגדית בו זמנית או עיכוב, בהתאמה pedicle כליות. מודלים אלה נותנים באופן עקבי עלייה לפגיעה בתפקוד הכלייתי וסיסטיק לאחר פציעה, אך חומרת פציעה והישרדות תלויות ברקע, גיל וכירורגי ציוד עכבר.
Abstract
פגיעה בכליות איסכמיה reperfusion מושרה חריפות (IR-AKI) היא בשימוש נרחבת כמודל של AKI בעכברים, אך תוצאות הן לעתים קרובות משתנים מאוד עם שיעורי תמותה גבוהים, בדרך כלל לא מדווחים שעשויה לבלבל ניתוחים. clamping pedicle כליות דו צדדית משמשת בדרך כלל כדי לגרום IR-AKI, אבל הבדלים בין לחצים יעילים מהדק ו / או תגובות הכליה לאיסכמיה בין הכליות לעתים קרובות להוביל לתוצאות משתנות יותר. בנוסף, ידועות פעמים מהדק קצרות יותר כדי לגרום לפגיעה בצינורי משתנה יותר, ואילו עכברים שעברו פגיעה דו צדדית עם זמנים ארוכים יותר לפתח פציעת מהדק צינורי עקבית יותר, לעתים קרובות הם מתים בתוך 3 הימים הראשונים לאחר פגיעה עקב אי ספיקת כליות חמורה. כדי לשפר את ההישרדות לאחר פציעה ולהשיג תוצאות יותר עקביות וצפויות, פיתחנו שני מודלים של פציעת איסכמיה reperfusion חד צדדית ואחרי כריתת כליה הנגדית. שני הניתוחים מבוצעים באמצעות גישת גב, הפחתת לחץ כירורגית כתוצאה Flaparotomy הגחון ROM, משמש בדרך כלל לניתוחי IR-AKI עכבר. לאינדוקציה של BALB / ג פציעה בינוני לעבור חד צדדי ההידוק של גבעול כליה עבור 26 דקות וגם לעבור כריתת כליה הנגדית בו זמנית. שימוש בגישה זו, 50-60% מעכברים לפתח HR המתון AKI 24 לאחר פציעה אבל 90-100% מעכברים לשרוד. כדי לגרום לאקי חמור יותר, BALB / ג לעבור pedicle כליות הידוק למשך 30 דקות ואחרי כריתת כליה הנגדית 8 ימים לאחר פציעה. זה מאפשר הערכה תפקודית של התאוששות כליה לאחר פגיעה עם 90-100% הישרדות. נזק מוקדם לאחר פציעת צינורי כמו גם סיסטיק פגיעה פוסט עקבי ביותר משתמש במודל זה.
Introduction
מגוון רחב של דגמים ניסיוניים של ניזק כלייתי חריף (AKI) פותחו כדי להתאים את המגוון ומורכבות של המצב האנושי (ראה התייחסות לביקורת האחרונה, מקיפה 1). כל אחד מהמודלים הללו יש יתרונות וחסרונות משלה, ובעוד כל אחד מחקה את התנאים האנושיים המתאימים עם יעילות מגוונת, אף אחד בדיוק מודל הפתופיזיולוגיה של עמיתיהם האדם שלהם. reperfusion איסכמיה (IR) הנגרמים AKI פותחה כמודל של פגיעת כלייתית הנגרמת איסכמיה חריפה במכרסמים. בעוד חומרת פגיעת כלייתית צינורי לראות במודל זה היא ציין רק לעתים נדירות בחולים עם פציעות hypoperfusion כליות 2, על אף מגבלותיו ובעיקר בגלל האופי לשעתק יחסית של מודל זה, השימוש הנרחב שלה סיפקה, והוא צפוי, ימשיך כדי לספק תובנות חשובות לרבים מהמנגנונים המשותפים הבסיסיים של אקי, התיקון, וטיפול 3. IR ניתוח דורש familiarity עם האנטומיה כליות העכבר, מה שיש לנו שמודגמות בצורה פשוטה יותר באיור 1. (IR) ניתוח פציעת איסכמיה reperfusion כליות יכול להתבצע באמצעות הגחון (laparotomy) או הגבי (retroperitoneal) גישות. אנו משתמשים בגישה הגבי שכן הוא פחות טראומטי, ומאפשר החלמה מהירה יותר פעמים והישרדות משופרת (במיוחד כאשר לומדים את ההליך ראשון). פציעת IR כליות יכולה להתבצע באופן חד צדדי או דו צדדי. עם זאת, הבדלים בין לחצים יעילים מהדק (העשויים לנבוע מחציצה של שומן perihilar בין לסתות מהדק) ו / או הבדלים בתגובות בין הכליה לאיסכמיה צדדים מובילים לתוצאות משתנות יותר. אמנם זה לא בעיה בלתי עבירה, זה יכול להגדיל את השונות בין ניסויים, אשר היא בעיה רצינית עבור דגם זה. IR חד צדדי ניתן לבצע עם כריתת כלית קונטרה, לרוחב. זו השיטה שלנו לבחירה שכן הוא מפחית את השונות בהידוק בין pedicles, ובו בזמןllows אחד כדי להעריך את תפקוד כליות, שאינו מושפע עם IR חד צדדי בלבד. יש כבר דיון על מה היא השיטה המעשית לעומת אופטימלית ביותר להערכת תפקוד כליות בעכברים. חנקן אוריאה דם (BUN) מספק מדד לתפקוד כליות ומהווה סמן שימושי "מבט ראשון" בכמה דגמים של אקי, כולל פגיעת IR. עם זאת, יכולות להיות מושפעות ברמות BUN ידי מעמד נפח של העכברים אשר עשוי להיות מושפעים, במיוחד לאחר פציעת IR גישת הגחון, כאשר התאוששות מתעכבת מפחיתה את הצריכה אוראלית של נוזלים במשך מספר הימים לאחר ניתוח. קריאטינין בסרום מושפע פחות ממצב הידרציה אבל בבירור מושפע מסת שריר. אחד הקשיים עם מדידות קריאטינין בסרום היה בעיות עם זיהוי של chromogens הלא קריאטינין בסרום עכבר תוך שימוש בטכניקות המבוססות על חומצת picric. כחלופה, מספר המרכזים פיתחו שיטה מבוססת HPLC לכמת קריאטינין העכבר שאינו מושפע מ4 החפץ הזה. עם זאת, UNLאייק לחמנייה ומבחני קריאטינין חומצת picric, שרק דורשים μl 5-10 של סרום, HPLC-מבחני דורשים ~ סרום 25 μl לassay, שאם מתבצע בכפולות ידרשו ~ 100 μl של דם מלא לassay. זו יכולה להיות מגבילה עבור מחקרי עכבר. מרכזים מסוימים פיתחו שיטות HPLC והמוניות המבוסס על ספקטרומטריית רגישות יותר, המאפשרות ניתוח של כמויות קטנות יותר לדוגמה 5, 6. עם זאת, טכנולוגיות אלה אינן זמינות באופן נרחב. , Assay מפל האנזימטית חלופי (אשר דורש μl 5-10 רק של סרום) הוערך בעכבר ובדגימות סרום חולדות והראה במקביל מקרוב מדידות HPLC של קריאטינין בסרום בעוד שמבחני picric החומצה תמיד ערכי קריאטינין מעל אומדן 7. בעוד assay זה אינו בשימוש נרחב בספרות אקי, assay הוא זמין באופן מסחרי, פשוט לשימוש, ואנחנו מוצאים את נותן תוצאות אמינות עם המודל הזה של IR-Induced AKI בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- חיטוי כל מכשירי הניתוח לפני הניתוח. שים לב שאם אחת הוא ביצוע ניתוחים רבים על עכברים שונים, לשטוף כלים לאחר שימוש ולאחר מכן לעקר באמצעות מעקר חרוז חם. זה לא מספיק כדי להשרות ב70% אתנול.
- תן מלח 0.5 מיליליטר S / C סטרילי נורמלי לפני ניתוח ומייד לאחר הניתוח, כדי לפצות על אובדן הנוזלים בגוף במהלך ניתוח.
- לשקול את העכברים.
- הרדימי עכבר באמצעות Xylazine IP / תערובת קטמין. זה בדרך כלל לוקח 3-5 דקות לעכברים להגיע למטוס הרדמה כירורגית.
- לגלח את האתר כירורגית עם אזור גבול מספיק כדי לשמור על שיער מהזיהום באתר החתך. זו צריכה להתבצע באזור הכנה, לא שבו הניתוח מתבצע.
- החל משחה סיכה העיניים לעיניים כדי למנוע ההתייבשות במהלך ההליך.
- מניחים את העכבר על פני השטח נוטה מחוממים מכוסים במשטח ספסל סופג. רגלי קלטת למשטח כירורגית.
- אם באמצעותמערכת אמבט מים, חום נקבע על 38 ° C שעה 1 לפני הניתוח.
- הכנה מזוהם באמצעות בטאדין פתרון ספוגית מקל: לקרצף מהמרכז לכיוון הפריפריה אתר 3x, בכל פעם ואחרי קרצוף עם Nolvasan להסיר פולידין. כל בטאדין יש להוציא מהתחום כירורגית לפני החתך על ידי שטיפה עם Nolvasan. לפני שמתחיל הליך כפפות אספטיים צריכים להיות שונה כדי להיות סטרילי.
- כיסוי תחום כירורגית עם וילון כירורגי סטרילי. זה ימנע שיער תועה מלהיכנס לשדה הניתוח ולספק אזור שעליו שכב מכשירים סטריליים במהלך ניתוח.
- למשש מיקום כליה דרך העור.
- חותכים את עור הגב לאורך קו האמצע של עכבר (כ -1.5 ס"מ) באמצעות מספריים ומלקחיים.
- עור נפרד ושכבות תת עורי מעל גב הצדדים ימני והשמאליים דרך חתך זה על ידי נתיחה בוטה באמצעות מספריים ומלקחיים.
- לעשות חתך קטן דרך fl הנכוןank שריר וfascia מעל הכליות וexteriorize הכליה הימנית.
- זהירות לנתח קטבים העליונים ותחתונים של הכליות חינם מרקמה הסובבת. שימו לב כי רקמת שומן מסביב הקוטב העליון מכילה את בלוטת יותרת הכליה ביצוע אספקת הדם משלו שיכול להיות דחפה את הכליות אבל ברור שלא צריך להיות מוסר מהעכבר (איור 1). לאחר כליות משחררים מהרקמה שמסביב, לקשור את תפר משי 4-0 סביב hilum של הכליה הימנית באמצעות קשר כירורגית כפול. להשאיר קצה אחד של התפר ~ 2 בזמן להחזיק את הכליות כמו שאתה חותך את הקשר הדיסטלי לכך שאתה יכול לדמיין את האתר כדי להיחתך. להשקות את הגדם עם תמיסת מלח סטרילית.
- סגור את שכבת השריר באמצעות תפר נספג.
- לעשות חתך קטן דרך שריר האגף השמאלי וfascia מעל הכליות וexteriorize הכליה השמאלית (איור 2 א).
- להחזיק בזהירות כליות באמצעות מלקחיים בוטים תוך שחרור הכליותגבעול מרקמות שומן באמצעות מלקחיים (איורים 2 ב-2F). יותר מדי לחץ על הכליות באמצעות מלקחיים הבוטים עלולים לגרום לפגיעה בכליה ולכן אחד צריך לזכור את זה בעת תכנון בקרות "אחיזת עיניים" ללימודים. אם אתה מוצא כי בקרות הדמה שלך מתפתחות פגיעה בכליה (כפי שמעיד עלייה בקריאטינין בסרום), שיטה חלופית אתה יכול לשקול כדי לשחרר את רקמות שומן מסביב מגבעול הכליות היא לגלגל את הרקמות בעדינות עם סטרילי ספוג מלוחה כותנה מטליות שקצהו. מניסיוננו השומן די מחובר באופן הדוק לגבעול כליות ולא יכול בקלות להסיר עם צמר גפן, ולכן זה לא יכול להיות הגישה הראשונה שהיית רוצה להשתמש בו. עם זאת, כמו בהיבטים אחרים של מודל זה, זה משהו שיצטרך לקבוע לעצמך עם תרגול וניסיון.
- הצמד עזב כליות pedicle באמצעות מהדק כלי דם טראומטי שאינו מחזיקים באמצעות מלקחיים (כדי להקל על מיקום מהדק), השתמש בטיימר לCLA שונההפעמים mp בהתאם לזן העכבר וחומרת פגיעה הנדרשת (ראה טבלה 1).
- לכסות את הכליה השמאלית ועור (איור 2H).
- לכסות את החתך בעור עם גזה ספוגה בתמיסת מלח.
- Exteriorize כליות, לאשר מראה אחיד כהה ולשחרר את המהדק לאחר המועדים המצוינים, ולוודא כי מראה אפלולי הופך אחיד בכליות (איור 2I / G). אם הכליות לא במהירות ובאופן אחיד מחדש perfuse (עד ורוד) העכבר צריך להיות מחוץ לניתוח נוסף. דחפו בעדינות בחזרה לתוך כליות חלל retroperitoneal.
- סגור את שכבת השריר באמצעות תפר נספג.
- סגור את שכבת העור באמצעות תפר שאינו נספג ניילון חוט חד.
- לנהל עצירות שיכוך כאבים.
- העבר את העכברים משדה הניתוח על גבי כרית חימום עד שהם מתעוררים.
- להחזיר את העכברים לחדר של בעלי חיים.
- לעקוב מקרוב אחר העכברים ולתת מנות נוספותשל עצירות כפי שצוין לעיל בכל 8-12 שעות לכאב או אי נוחות. סימנים קליניים וכתוצאה מכך המתן של משככי כאבים דיכאון כוללים שינויים התנהגותיים או אחרים, מראה נורמלי, או תנוחה כגון Pilo-זקפה, יציבה כפופה, חוסר טיפוח ואכילה, או חוסר תנועה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR המתון IR-Induced AKI. חד צדדי עם כריתת כליה הנגדית בו זמנית באופן משמעותי מפחית שונות בתוצאות, אבל עם זמנים קצרים יותר מהדק הדרושים לעכברים כדי לשרוד בהליך זה, אנחנו עדיין מצאנו כי רק 50-60% מעכברים פיתחה אי ספיקת כליות 24 שעות הצפויות לאחר פציעה (איור 3 א). במונחים מעשיים זה יוצר קשיי הערכת הנתונים, אלא אם כן את הלימודים כרוכים במשטרי טיפול שיכול להינקט לפחות 24 שעות לאחר פציעה, ומאפשרים זמן כדי להעריך את תפקוד כליות וזורקים עכברים שלא לפתח אי ספיקת כליות.
חמור AKI IR-Induced. בנוסף לביצוע IR חד צדדי עם כריתת כליה הנגדית בו זמנית, אנו מבצעים IR חד צדדי בלבד. עכברים יכולים לשרוד תקופות ארוכות יותר של איסכמיה ונוטים לפתח סיסטיק לאחר פציעה חמורה יותר. באותה תקופה של איסכמיה, עכברים נתון deve איסכמיה החד צדדיפיברוזיס חמור יותר מאשר לגדוע איסכמיה דו צדדית או חד צדדית עם איסכמיה כריתת כליה 8, ולכן מודל זה משמש גם כמודל להודעת AKI-סיסטיק. החסרון הוא שזה לא ניתן להעריך התאוששות תפקודית לאחר פציעת IR חד צדדית, כך שאין דרך להעריך את חומרת פגיעה ללא קצירת רקמות כליה, וכי ייתכן שלא ניתן למחקרים לטווח ארוך יותר. מסיבה זו פיתחנו פרוטוקול לגרימת פציעת IR חד צדדית חמורה, והערכת החלמה תפקודית כליה על ידי ביצוע כריתת כליה הנגדית 8 ימים לאחר הפציעה המקורית. שימוש בגישה זו 90-100% מעכברים לשרוד את הפציעה, אבל חשוב מכך העכברים לפתח פגיעת כלייתית מאוד עקבית וניתן להעריך להחלמה תפקודית לאחר אקי מיום 9 ואילך (איור 3). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים בחולדות מצביעים על כך שפעמי מהדק pedicle כליות עוד לגרום לפגיעת כלייתית צינורי מכוננת יותר מקצר המהדק TI MES נועד לגרום קל עד בינוני אקי 9. בנוסף לכך, עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים 8, עכברים אלה לפתח הודעה סיסטיק כליות פציעה (שיש לנו להעריך ביום 28) באופן עקבי. זה לא קשור לחלבון לפחות על רקע BALB / ג: לאחר חמור IR-AKI ביחס יום 28 לאחר פציעת שתן אלבומין / קריאטינין הוא 0.8 ± 0.04 (ממוצע ± SEM במיקרוגרם / מ"ג). לא ידוע אם דגם IR-AKI החמור מעורר פרוטאינוריה על רקע אחר.
איור 1. אנטומיה של מיקום עכבר כליות hilum. הממחישות של נדן כליות כלי הדם ביחס לשופכן, רפידות שומן perinephric ובלוטת יותרת הכליה באספקת דם. העיגול השחור מסמן עמדה של מיקרו מהדק.
50495/50495fig2.jpg "/>
איור 2. חשיפה והידוק של כלי דם בכליות נדן עכבר (), חשיפה של הכליה השמאלית לאחר נתיחה של עור ושכבת שריר;. (ב - ה), הכליה השמאלית מתקיימת בעדינות באמצעות מלקחיים בוטים ואילו שומן perinephric מוסר בזהירות באמצעות מלקחיים. (F), חשוף שמאלה (חץ ירוק) pedicle כליות. הקו המקווקו הלבן מסמן את המיקום הצפוי של השופכן בתוך כרית שומן perihilar. אזור זה צריך להימנע עם המהדק של כלי הדם. (G), מיקרו המהדק פנה לכליה השמאלית. (H), הדק כליה שמאלית מכוסה בעור. (אני), (ג), על מראה של הכליה לפני (א '), במהלך (אני) ואחרי (G) לאחר ההסרה של המהדק של כלי הדם.
fig3.jpg "/>
איור 3. התאוששות תפקודית לאחר AKI. שינויים בקריאטינין בסרום (על ידי מבחני אנזימטיות) לאחר פציעת IR מתונה (26 דקות זמן מהדק) וכריתת כליה הנגדית (), שינויים בקריאטינין בסרום לאחר גיוס של פגיעה חמורה (30 דקות זמן מהדק) וכריתת כליה הנגדית ב יום 8 (ב '). שבוצעו בעכברי BALB / ג מחקרים, n = 6 לכל קבוצה. תוצאות מבוטאות כממוצע + /-SEM סרום קריאטינין במ"ג / ד"ל, נמדד באמצעות assay אנזימטי.
| זן עכבר | גיל משוער מאוס | משקל עכבר משוער | הצמד סוג | חברה ומספר קטלוג | זמן איסכמיה לפציעה חמורה | זמן איסכמיה לפציעה בינונית | כרית חימום טמפרטורה |
| BALB / ג 4-5 חודשים | 25-28 גרם | מהדק של כלי דם (לחץ גרם 795) | Roboz, RS-5459 | 30 דקות (או יותר) | 26 דקות | 38 מעלות צלזיוס | |
| C57BL / 6 | 4-5 חודשים | 24-27 גרם | מהדק של כלי דם (לחץ גרם 795) | Roboz, RS-5459 | 29 דקות (או יותר) | 26 דקות | 38 מעלות צלזיוס |
| CD1 | 4-5 חודשים | 36-39 גרם | מהדק של כלי דם (לחץ גרם 75-85) | FST, 18,055-02 | 29 דקות (או יותר) | 26 דקות | 38 מעלות צלזיוס |
טבלת מס '1. מומלץ מלחציים כלי דם, זמני איסכמיה, וזני עכבר שיש לנו הערכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שני מודלים של IR-AKI כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת כלייתית בינונית וקשה. מודלים אלה מאפשרים לנו לגרום לפציעה עקבית וצפויה עם תמותה נמוכה. הפרוטוקול שלנו מתאר רבים מהקשיים והחסרונות הקשורים באופן מסורתי עם המודל הזה. יתר על כן, יש לנו הראינו כי בהתאם לאורכו של גבעול clamping כליות, גורם למודל מתון המתון AKI בעיקר הפיך, או AKI חמור יותר עם התאוששות חלקית וסיסטיק כליות כרוני. סיסטיק לאחר פציעה בדגם IR-AKI החמור עלול להיגרם כתוצאה מהעובדה שהעכברים מסוגלים לשרוד עם פגיעת כלייתית חמורה יותר יהיה אפשרי אם כבר פעמים איסכמיים אלה שבוצעו בילטרלי. עם זאת, יש גם ראיות לכך שהנוכחות של כליה הנגדית ללא פגע בימים הראשונים לאחר IR משפרת הודעה AKI-סיסטיק 8. לכן, בעוד שהמנגנונים של שיחת הכלאה בין הכליות ללא כל פגע ופצועים להישאר להיות established, מנגנון זה עשוי גם להסביר לסיסטיק לאחר פציעה המשופרת שאנו רואים במודל זה. למרות שזה עדיין לא נקבע אם ניתן לתרגם את הממצאים תוך שימוש במודלים אלה לתרופות למחלות של בני אדם, הם מספקים מודלים אמינים ללמוד מנגנונים ותרופות בIR-AKI וכדי למנוע הודעה AKI-הכליה פיברוזיס, בעיה קלינית שמתגלה כ תורם עיקרי במחלה פרוגרסיבית כרונית כליות 10, 11.
ישנן מספר בעיות קריטיות שיכול להשפיע על חומרת AKI בעקבות פציעת IR שצריך להיות במעמד בזהירות ל: זן עכבר 12, מין 13, גיל 14 ובמשקל של העכבר, המהדק של כלי הדם בשימוש, ומערכות חימום 15. בחירת מהדק של כלי הדם הנכון יכולה להיות אתגר. יעילות של המהדק נבחנת במהלך ההליך הכירורגי ככליה צריכה להיות שחורה באופן אחיד בתוך 5-10 דקות של מיקום מהדק. עם זאת, הוא גם important שכל הכליה מחדש perfused (רודים מעלה) במהירות לאחר הסרת המהדק. מצאנו כמה ממלחציים הכבדים יותר לעבוד היטב עם זנים מסוימים (למשל BALB / ג וC57BL / 6), אבל באחרים מהדק אלה לגרום לפציעה של כלי דם וכליות reperfusion היא לעתים קרובות לא שלמה (לדוגמה: דיסק 1). סיכום של מלחציים כלי הדם, משקולות מהדק (לחץ) וזני עכבר שיש לנו הערכה מופיע בטבלה 1. למערכות חימום, מספר החוקרים להשתמש בכריות חימום אוטומטית מוסדרות עם בדיקות טמפרטורה כדי לפקח ולשמור על טמפרטורת גוף קבועה. אמנם באופן תיאורטי יתרון, מצאנו מערכת חימום זה יכול לגרום לתנודות גדולות בטמפרטורת הגוף במהלך הניתוח, והוליד תוצאות די משתנות. בנוסף, מערכות אלו הן יקרות יחסית ולכן עלולים להגביל במספר עכברים אחד יכול לפעול על בכל זמן נתון. אחרי הרבה ניסוי וטעייה שעברנו לטמפרטורה קבועה, במחזור המים heaמערכת טינג. היתרון העיקרי של זה הוא שהפלטפורמה נותנת טמפרטורות החימום יציבות (38 מעלות צלזיוס) לאורך כל הניתוח. עם שטח הפלטפורמה הגדול אפשר גם לפעול במספר העכברים על פני השטח בכל זמן נתון (שהוא דרישה מעשית עבור רוב מחקרי IR-AKI). אחרי שאמר את זה, אנחנו לא מוצאים שם עדיין היה שונים משמעותיים בפציעה בעקבות מתון (אך לא חמור) IR-AKI. זו לא בעיה עבור מחקרים בהם טיפולים שיזמו 24 שעות או יותר לאחר פציעה, שכן עכברים מתפתחים מספיק או פציעה חמורה יתר על המידה ניתן להסיר מהמחקר לפני הקצאה אקראית על ידי ניתוח של קריאטינין בסרום. עם זאת, אם מטופלי עכברים שלפני פציעה, או אם נעשה שימוש במודלים גנטיים, פקדים נוספים על שונות ניסוייות ייתכן שיהיו הצורך הציג. מאז תנודות בטמפרטורת גוף ליבה עשויה להיות הגורם העיקרי לשונות בפציעת IR במודל זה, גישה אחת כדי להגביל את ההשתנות יהיה מ 'טמפרטורות ליבת onitor באמצעות בדיקות פי הטבעת על מנת לקבוע בעלי החיים מתאימים כדי לכלול או לא לכלול בניתוחים שלאחר מכן. השיקולים הסופיים הם גיל עכבר, משקל, ומין. רוב הניסיון שלנו כבר עם BALB / ג, ויש לנו להשיג את התוצאות הטובות ביותר כאשר עכברים להגיע למשקל גוף יציב על ידי 4-5 חודשים של גיל, עם משקל גוף ~ 25-28 גרם. לבסוף, מאחר שיש לי זכרים רגישות רבה יותר לIR-AKI מאשר נקבות 13, אנו מבצעים את כל המחקרים שלנו באמצעות עכברי זכרים בלבד. עם זאת, יש משתנים נוספים, שהנם קשים לשליטה, ולכן בכל מעבדה וכל חוקר צריכים להקים פעמים מהדק מדויקות ותנאים כדי לגרום לחומרת פגיעה שהם רוצים בזן העכבר של הבחירה שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש סופרים אין ניגודי האינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מעבדתו של ד"ר דה Caestecker נתמכת על ידי NIH 1RO1 HL093057-01 ו1RC4DK090770-01. המעבדה של ד"ר האריס נתמכת על ידי DK38226, DK51265, DK62794 ומימון ממנהל הוותיקים. תמיכה עבור ניתוחי עכבר כליות פציעה, קריאטינין בסרום, מבחני סיסטיק גם הניתנים על ידי או 'בריין ונדרבילט הכליה פגיעה מרכז מענק 1P30 DK079341.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15" W x 24" Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2’’ x 2’’ Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. | |||
References
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P.
