Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het identificeren van een populatie van enucleating orthochromatische erytroblasten van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, die een visualisering van de erytroblast enucleatie proces.
Abstract
Erytropoëse in zoogdieren wordt afgesloten met het dramatische proces van enucleatie dat resulteert in reticulocyten formatie. Het mechanisme van enucleatie is nog niet volledig opgehelderd. Een veelvoorkomend probleem bij het bestuderen van de lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erytroblasten microscopisch is de moeilijkheid om een voldoende aantal cellen die enucleatie nemen. We hebben een nieuwe analyse protocol ontwikkeld met multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging flowcytometrie), een methode die immunofluorescente microscopie gecombineerd met flowcytometrie, teneinde efficiënte manier een groot aantal enucleating gebeurtenissen die toelaat verkrijgen metingen en statistische analyses uit te voeren.
We beschrijven eerst hier twee in vitro erytropoëse cultuur methoden die worden gebruikt om muizen erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen van enucleatie bij The tijd van evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie. Samen met de grootte en DNA/Ter119 vlekken die worden gebruikt om de orthochromatische erytroblasten identificeren, maken we gebruik van de parameters "aspect ratio" van een cel in de bright-field kanaal dat helpt bij de erkenning van langgerekte cellen en "delta centroïde XY Ter119/Draq5 "waarmee de identificatie van cellulaire gebeurtenissen waar het centrum van Ter119 kleuring (ontluikende reticulocyten) is ver uit het centrum van Draq5 kleuring (nucleus ondergaan extrusie), hetgeen wijst op een cel over te ophelderen. De subset van de orthochromatische erythroblast bevolking met een hoge delta zwaartepunt en lage aspect ratio wordt sterk verrijkt in enucleating cellen.
Introduction
Terminale differentiatie in de erytroïde afstammingslijn bij zoogdieren eindigt met de dramatische proces van enucleatie, waardoor de orthochromatische erytroblast verdrijft het membraan omhulde kern (pyrenocyte) 1, het genereren van een reticulocyten 2. Het exacte mechanisme van deze werkwijze, die ook de snelheidsbeperkende stap van succesvolle, grootschalige productie van rode bloedcellen in vitro, is nog niet volledig opgehelderd. De lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erythroblasten gebaseerd op het gebruik van fluorescente en elektronenmicroscopie 3-5. Dit moeizaam proces resulteert typisch in de identificatie van een beperkt aantal enucleatie evenementen en niet altijd mogelijk zinvolle statistische analyse. Voortbouwend op een werkwijze erytroblast identificatie eerder beschreven door McGrath et al.. 6, hebben wij een nieuwe benadering voor het identificeren en bestuderen enucleatie gebeurtenissen door Multi-Spectral Ima ontwikkeldGing flowcytometrie (multiparameter snelle celweergave in flow, een methode die fluorescentiemicroscopie met flowcytometrie combineert) 7, dat een voldoende waarnemingen kan leveren uitvoeren van metingen en statistische analyse.
Hier beschrijven we eerst twee in vitro erytropoëse kweekmethoden gebruikt om erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen enucleatie bij de evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie.
Monsters worden uitgevoerd op een imaging flowcytometer en de verzamelde cellen adequaat gated om orthochromatische erytroblasten 6 identificeren. Orthochromatische erythroblasten worden vervolgens geanalyseerd op basis van hun verhouding, gemeten helderveld imaGing, versus de waarde voor de parameter delta zwaartepunt XY Ter119-DNA, dat wordt gedefinieerd als de afstand tussen de middelpunten van de gebieden, respectievelijk gekleurd voor Ter119 en DNA. De populatie van cellen met een lage aspect ratio en een hoge delta centroïde XY Ter119/DNA is sterk verrijkt in enucleating cellen. Met behulp van wild-type (WT) erytroblasten versus erytroblasten met Mx-Cre-gemedieerde voorwaardelijke schrapping van Rac1 op Rac2 - / - of gecombineerd Rac2 - / -; RAC3 - / - genetische achtergrond en deze nieuwe analyse protocol van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, we onlangs aangetoond dat enucleatie lijkt asymmetrische cytokinese en dat de vorming van een ring actomyosine gedeeltelijk gereguleerd door Rac GTPases is belangrijk voor enucleatie progressie 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lange termijn In vitro Erythropoiesis Cultuur (Ex vivo Erythroid Differentiatie Cultuur Protocol door Giarratana et al.. 8, gewijzigd en aangepast voor Mouse Cells)
Dit is een 3-stap op lange termijn in vitro erytropoëse protocol. In de eerste stap (dagen 0-4) 2 x 10 5 cellen / ml worden in erytroblast groeimedium aangevuld met stamcelfactor (SCF), interleukine-3 (IL-3) en erythropoietine (Epo). In de tweede stap (5-6 dagen) worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 2 x 10 5 cellen / ml en co-gekweekt op hechtende stromacellen (MS5) in vers kweekmedium aangevuld erytroblast alleen Epo. In de derde stap (dagen 7-9), cellen gekweekt op een laag van MS-5-cellen in vers erytroblast groeimedium zonder cytokinen tot enucleatie (figuur 1A).
Alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) vanMedisch centrum Kinderen van Cincinnati.
- Oogst van botten en isolatie van lage-dichtheid beenmergcellen
- Voeg 2 ml steriel IMDM dat 2% foetaal bovine serum (FBS) in een 15 ml conische buis en blijf op ijs.
- Euthanaseren een 2-6 maand oud wild type C57/BL6 muis (samen met of zonder genetisch gerichte muis van rente) na-instelling goedgekeurde protocol (bijv. CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie).
- Isoleer bekken, scheen-, en tibiae van beide benen met behulp van pincet en scalpel, voeg ze toe aan de buis met IMDM 2% FBS en blijf op ijs.
- Voeg 1 ml IMDM 2% FBS in een steriele flow cytometrie buis en flush botten behulp van een tang en een tuberculine spuit met een 25-G x 5/8 "naald. Flush IMDM 2% FBS door de botten een paar keer zachtjes ( door opzuigen ~ 500 pi van de celsuspensie en opnieuw spoelen door het bot), en verzamel de beenmergcellen in de stroom-cytometry buis. Vlissingen is voltooid wanneer de botten verschijnen wit.
- Filter cel-suspensie door een 40-um cel zeef set op de top van een 50 ml conische buis. Was cel zeef met IMDM 2% FBS en met hetzelfde medium regelen eindvolume van celsuspensie tot 5 ml.
- Bereid een lage dichtheid beenmergcellen (LDBM) door dichtheidsgradiëntcentrifugatie: zorgvuldig te laag van de 5 ml celsuspensie op 5 ml dichtheid gradiënt celscheiding medium 1,083 g / ml in een 15 ml buis en draaien op 750 xg gedurende 25 min bij kamertemperatuur (RT) zonder rem / lage versnelling.
- Overdracht supernatant (alles tot ongeveer de streep 2 ml van de 15-ml buisje om buffy coat verwerven) een nieuwe 15 ml buis en voer nog een wassing met IMDM 2% FBS bij 525 xg gedurende 5 minuten bij RT.
- Zuig supernatant en lyseren resterende rode bloedcellen (RBC) suspenderen van de pellet in 3 ml RBC lysis buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Indien een grotere zuiverheid van erytroblasten isvereist bij de laatste stap (bijv. voor biochemische studies), zuiveren LDBM cellen verder bij deze stap naar Lin neg cellen door magnetische scheiding.
- Ex vivo erythroid differentiatie cultuur protocol vanaf LDBM of Lin neg cellen (figuur 1A)
- 7 ml IMDM Voeg 2% FBS, rotatie bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 2 ml erytroblast groeimedium (EGM), bestaande uit:
een. StemPro-34-medium, dat
b. 2,6% StemPro-34 medium supplement,
c. 20% BIT-9500,
d. 900 ng / ml ijzersulfaat,
e. 90 ng / ml ijzernitraat,
f. 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine
g. 10 -6 M hydrocortison
h. en vers toegevoegd cytokines:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml IL-3 en
iii) 3 IU / ml Epo. - Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig op een microscoop met een zoomocytometer.
- Plaat in een 6-well celcultuur plaat bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / putje tot een eindvolume van 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 LDBM cellen / ml) en incubeer bij 37 ° C (dit wordt beschouwd als de dag # 0 van cultuur).
- Opnieuw medium door afzuigen 1,5 ml van de supernatant, het spinnen bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opnieuw suspenderen in 1,5 ml vers medium dat alle 3 de cytokines voegen naar de putjes elke dag op dagen # 2, 3, 4, optimaliseren proliferatieve fase. Op dag 3, verwijder alle cellen tellen en verdeeld in geschikte aantal putten om goed celconcentraties van ~ 2 x 10 5 cellen / ml te ondersteunen. Handhaaf cultuur bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Op dag 4, plaat MS5 cellen (muizen stromale cellijn) in de putjes van een nieuwe cel-cultuur 6-wells plaat. De MS5 cel-kweekmedium α-MEM bevattende 20% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine.
- Op dag 5, telt het aantalcellen (thans aanzienlijk verrijkt in erytroblasten) in elk putje van de oorspronkelijke petrischaal met een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig op een microscoop met een hemocytometer.
- Lift alle cellen uit elk putje en overbrengen naar 15 ml conische buizen, spin down 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, aspireren supernatant en los pellets met vers EGM die slechts Epo (3 IU / ml) tot een concentratie van 2 x 10 5 cellen / ml.
- Zuig supernatant van de putjes waar MS-5-cellen werden uitgeplaat gisteren (gericht op 70-80% confluentie op het moment van co-cultuur) en voeg de erythroïde cellen in deze putten in EGM met alleen Epo (hoewel hun medium keuze, MS-5-cellen overleven goed in EGM voor meerdere dagen).
- Wijzig medium toevoegen van verse EPO op dag # 6.
- Opnieuw medium op dag # 7, met EGM zonder toegevoegde cytokinen. Op dagen 7 tot en met 9, de monsters voor enucleatie met flowcytometrie na kleuring met anti-Ter119 en Syto-16 dagelijkse en proceed tegen vlekken monsters voor Multi-Spectral Imaging flowcytometrie (zoals beschreven in paragraaf 3).
Opmerking:. Voordat plating en op dag 2, 4, 6, en 7 van de cultuur, bewaken gekweekte cellen voor erythroblast verrijking en differentiatie met flowcytometrie door beoordeling oppervlakte markers CD44 en Ter119 vs grootte (FSC) 9 alternatief CD71, Ter119 en FSC kan ook 10, 11.
- 7 ml IMDM Voeg 2% FBS, rotatie bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 2 ml erytroblast groeimedium (EGM), bestaande uit:
2. Fast Enucleatie Assay, Volgens het protocol Beschreven door Yoshida et al.. 12 met wijzigingen (Figuur 1B)
- Stress erytropoëse inductie en stroma celpreparaat voor in vitro erytropoëse cultuur
- Verdoven een 2-6 maand oud wild type C57/BL6 muis per IACUC richtlijnen (bijv. met isofluraan oplossing). Zorg ervoor dat de muis voldoende is verdoofd door te controleren op afwezigheid van reflexieve reacties op een zachte achterste poot knijpen en voorregelmatige ademhaling tijdens de procedure. Gebruik dierenarts oogzalf op de ogen tot droog te voorkomen, terwijl onder verdoving.
- Induceren van stress erytropoëse via staart bloeden tot een uiteindelijk volume van 500 pi. Met een insulinespuit, injecteer gelijk volume normale zoutoplossing intraperitoneaal aan vloeistofresuscitatie van het dier (houd dier Trendelenburg voor het injecteren en injecteren in de onderbuik, zodat er geen interne organen beschadigen) verzekeren.
- Laat de muis niet onbeheerd achter totdat het motorische controle heeft herwonnen, zoals aangegeven door het dier begint te bewegen rond de kooi en te kunnen staan en lopen zonder te vallen. De Phlebotomized muis in een kooi geplaatst, zonder andere muizen.
- Na 2 dagen, plaat MS-5-cellen in putjes van een 24-well celcultuur plaat. Incubeer MS-5-cellen bij 37 ° C / 5% CO 2 in MS5 celmedium (a-MEM bevattende 20% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) met het doel om 70-80 % samenvloeiing in putjes na 48 uur.
- Oogst van milt en verwerking van splenocyten
- Vier dagen (96 uur) na het stress-erythropoiesis inductie, Euthanaseren eerder gebloed muis via IACUC-goedgekeurde protocol (bijv. CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie).
- Oogst milt en zet het in een 15 ml conische buis met IMDM 2% FBS en blijf op ijs.
- Terug in het laboratorium, in weefselkweek kap onder steriele omstandigheden, zwenken milt-bevattende buis op een 40-um cel zeef op de top van een 50 ml buisje. Crush milt met behulp van de zuiger van een 5-ml plastic spuit.
- Was cel zeef met IMDM 2% FBS en met hetzelfde medium, het eindvolume celsuspensie passen aan 5 ml.
- Laag het 5 ml splenocyt suspensie voorzichtig op 5 ml dichtheid gradiënt celscheiding medium 1,083 g / ml in een 15 ml buis en draaien op 750 xg gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur zonder rem / lage versnelling.
- Overdrachtsupernatant (oplossing tot ongeveer de 2-ml-markering van 15 ml buis om buffy coat verwerven) een nieuwe 15 ml buis en voer nog een wassing met IMDM 2% FBS bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur .
- Zuig supernatant en lyseren rode bloedcellen door het suspenderen van de pellet in 3 ml RBC lysis buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- 7 ml IMDM 2% FBS aan de cellen te wassen en te verdunnen en neutraliseren de RBC lysis buffer en centrifugeren bij 525 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig supernatant en schorten gepilleerd cellen in 2 ml erythroblast groeimedium (EGM).
- Cultuur van de geïsoleerde lage-dichtheid splenocyten, verrijkt in erytroblasten, op kunststof (eerste fase van snelle in vitro erytropoëse cultuur)
- Tellen cellen op een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig door een hemocytometer. Gebruikelijk aantal cellen geïsoleerd per milt in dit stadium is ~ 15 x 10 6.
- Opschorten cellen verder in EGM met de cytokinen (bij fspronkelijke concentraties): SCF 50 ng / ml IL-3 5 ng / ml en Epo 2 U / ml.
- Plaat 1-5 x 10 6 cellen in een eindvolume van 1 ml / putje (hetzelfde aantal cellen per putje afhankelijk totale aantal cellen) van een 24-well celcultuur platen en incubeer O / N bij 37 ° C / 5% CO2.
- Cultuur van erytroblasten op MS5 cellen (tweede fase van snelle in vitro erytropoëse cultuur
- Zuig supernatans van de kunststof goed en til de cellen (sterk verrijkt in erytroblasten) door toevoeging van 2 ml koude 10 mM EDTA in PBS gedurende 5 min op ijs in elk putje.
- Plaats cellen in verse buizen keer wassen in EGM (zonder cytokinen) en resuspendeer in dezelfde.
- Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 cellen in een volume van 1-2 ml elk MS5-cel bekleed putje van een 24-wells plaat. Als farmacologische remmers worden gebruikt in het experiment, voeg ze op geschikte concentraties nu.
- Incubeer gedurende 6 tot 8 uur (tijd geleid doormicroscopische waarneming van ongeveer 30% -40% enucleatie in het onbehandelde monster WT). De binding van erytroblasten naar MS-5-cellen versnelt hun enucleatie.
- Til cellen uit elk putje door toevoeging van 2 ml koude PBS + 10 mM EDTA, gedurende 5 minuten op ijs. Samen met de erytroblasten, zal MS-5-cellen ook worden verzameld, maar deze kunnen later eenvoudig worden uitgesloten tijdens flowcytometrische analyse als FSC hi Ter119 - cellen.
- In dit stadium kunnen cellen worden gefixeerd en gekleurd voor analyse door Multi-Spectral Imaging flowcytometrie.
3. Kleuring van erytroblasten voor Lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipidevlotten Tijdens Enucleatie door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie
- Was de cellen in PBS, spinnen 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspireren supernatant.
- Fix cellen door resuspenderen celpellets in 500 ui 3,7% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten (fixatie kan variëren naargelang de antigen wordt gesondeerd) en pipetteren voorzichtig.
- Breng 1,5 ml plastic centrifugebuizen en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Spin op een bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en voer een wasbeurt door toevoeging van 500 pi PBS aan elke buis en voorzichtig pipetteren.
- Spin op een bankje microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en houden buizen op ijs gedurende minstens 15 minuten. Permeabilisering stappen 3,6-3,9 moet snel en efficiënt gebeuren, en na spinning / aspiratie bij RT, cel pellets moeten onmiddellijk worden terug gezet op het ijs, zodat de cellen beter hun integriteit behouden.
- Neem aceton oplossingen uit van -20 ° C vriezer en op ijs gezet. Permeabilize cellen door resuspenderen celkorrels eerst in 500 pi ijskoude 50% aceton (1:1 met dH 2 O) en pipetteren voorzichtig.
- Spin op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer cel pellets in 500 pi60; ijskoude 100% aceton door pipetteren voorzichtig.
- Spin op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer celpellets opnieuw in 500 pi ijskoude 50% aceton door pipetteren voorzichtig.
- Spin op bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en was cellen eenmaal in koude FACS-buffer (PBS + 0,5% BSA) door voorzichtig pipetteren.
- Bereid etikettering cocktail met antilichamen of markers voor de moleculen van belang: 0.1 U/100 ul AF488-phalloidin voor F-actinekleuring en 1 μl/100 pi Ter119-PECy7 voor erytroïd cel kleuring. Alternatieve of aanvullende kleuring kan ook via AF-488-anti-β-tubuline antilichaam (1:50), AF-594-geconjugeerde choleratoxine subunit B lipide rafts label (1:200), anti-pMRLC (Ser19) primair antilichaam voor het gefosforyleerde regulerende myosine lichte keten (1:50), gevolgd door anti-konijn AF-488-geconjugeerd secundair antilichaam (1:400) en anti-γ-Tubulin primaire konijn antilichaam (1:100), gevolgd door anti-konijn AF-555-geconjugeerd secundair antilichaam (1:300).
- Na aspiratie supernatant, resuspendeer celpellets in 100 pl van de marker cocktail, pipet zachtjes en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid FACS buffer met 2,5 uM van de nucleaire vlek Draq5.
- Was de cellen in FACS buffer, spin down op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer in 60 ul FACS buffer met Draq5.
- Voer monsters op een grafisch flowcytometer verzamelen ten minste 10.000 gebeurtenissen per experiment compenseren ruwe data bestanden eerder gepubliceerd 13, en de resultaten geanalyseerd zoals getoond in figuur 2, met de analysesoftware specifiek voor de beeldvorming flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerst worden de cellen geanalyseerd op basis van hun Brightfield Aspect Ratio (verhouding van de lengte van de kleine tegenover de hoofdas) en de helderveld Area (indicatie van hun grootte). Evenementen met een waarde Brightfield Area lager dan 20 en hoger dan 200 zijn meestal puin en mobiele aggregaten, respectievelijk, en zijn uitgesloten van de analyse (Figuur 2A). Enkele cellen (gate "R1") zijn vervolgens geanalyseerd op basis van hun waarde voor de parameter Gradient RMS, die de scherpte van het beeld aangeeft. Poort "R2" is gecreëerd met cellen met Gradient RMS-waarde meer dan 50 percentiel om de afbeeldingen goed genomen in beeld (figuur 2B) te selecteren. Cellen worden vervolgens gated basis van hun grootte, zoals gemeten door hun Brightfield Ruimte, en hun positiviteit voor de erythroid marker Ter119 zoals gemeten door de tl-parameter Ter119 vlek-Mean Pixel (gate "Ter119 positief", figuur 2C). Cellen zeer lage of zeer hoge voor Ter119, zijn ofwel niet-erythroids of resterende celaggregaten, respectievelijk, en zijn uitgesloten van de analyse. Daarna worden cellen geselecteerd op Draq5 beeldverhouding intensiteit (de verhouding van de kleinere ten opzichte van de hoofdas intensiteit van de kern) en de intensiteit van Draq5 (figuur 2D). Draq5 negatieve cellen (meestal ontkernde cellen, zoals reticulocyten en RBC's), en cellen met een lage Draq5 Aspect Ratio (meestal doubletten) zijn uitgesloten van de analyse. Draq5 positieve cellen (gate "DNA positief", vooral erythroblasten op dit punt) worden vervolgens geanalyseerd op basis van hun Ter119 Area, die de grootte van de cel en de Ter119 gemiddelde Pixel / Area (dichtheid van Ter119 expressie), welk aangeeft de helderheid van Ter119 kleuring. Orthochromatische erytroblasten (gate "OrthoE") erkend als kleine, Ter119 hi cellen (figuur 2E). Tenslotte, een subpopulatie van de orthochromatic erytroblasten hoogverrijkt in enucleating cellen wordt gekenmerkt door een lage Brightfield Aspect Ratio, dat is een meting van celstrekking, berekend door de verhouding van de korte as / hoofdas van cel beeld in de Brightfield kanaal M01, en door hoge Delta Zwaartepunt XY Ter119 / Draq5, die wordt bepaald door de afstand tussen het midden van de beginnende Ter119 +-reticulocyten en het centrum van de Draq5 +-kern (gate "enucleating cellen" in figuur 2F).
Samen met antilichaam tegen Ter119 en de DNA-vlek Draq5, hebben de cellen ook gekleurd voor draadvormige actine (F-actine) met fluorescerende phalloidin tot lokalisatie van F-actine te evalueren tijdens erythroblast enucleatie 7. Van de nota, kan een progressie van enucleatie worden gevisualiseerd in de vaste cellen, als cellen met een afnemende aspect ratio (dwz steeds langwerpig) en het verhogen van delta zwaartepunt XY Ter119/Draq5 worden waargenomen (FigUre 3). F-actine wordt waargenomen om zich te concentreren op het decollete vore tijdens enucleatie en vervolgens verdwijnen zodra de kern wordt geëxtrudeerd. Bovendien kan co-lokalisatie van actine en myosine aan het decollete groef tussen beginnende reticulocyten en kern worden aangetoond door multispectrale beeldvorming flowcytometrie na co-kleuring van WT erytroblasten voor pMRLC (gefosforyleerd myosine regulerende lichte keten) en F-actine 7.
Andere eiwitten en structuren van belang eveneens gekleurd met geschikte antilichamen of fluorescente merkers imaging studies hun rol tijdens enucleatie mogelijk. Gepolariseerde microtubulusvorming zichtbaar in WT orthochromatische erytroblasten vóór enucleatie maar niet erytroblasten behandeld met colchicine (figuur 4A). Remming van tubuline polymerisatie door colchicine vermindert cel polarisatie, zoals aangetoond door het meten van de parameter delta zwaartepunt XY BF/Draq5 tussen de center van het cellichaam gezien in Brightfield kanaal en het centrum van de nucleaire kleuring bereikt met Draq5 (Figuur 4B).
Gebruik makend van WT of Rac-deficiënte (na genetische of farmacologische manipulatie) erytroblasten in multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie toegestaan imaging studies die de rol van Rac GTPases in enucleatie demonstreren. Rac GTPases regelen ten minste gedeeltelijk de vorming van een actomyosine ring en de samenvloeiing van lipide rafts in de groef tussen beginnende reticulocyten en pyrenocyte 7.
Figuur 1. Schematische demonstratie van de erythropoiese in vitro protocollen gebruikt om enucleating erythroblasts voor studies produceren. A. Lange termijn in vitro erytropoëse cultuur initiated van LDBM of Lin -.. cellen B. Fast enucleatie test geïnitieerd door splenocyten hoogverrijkt in erytroblasten na spanning erythropoiesis inductie in vivo door aderlaten Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Analyse van gegevens met behulp van de analyse software specifiek voor de beeldvorming flowcytometer. Opeenvolgende gating van de populaties van belangstelling wordt getoond in panelen AF. Het getal tussen haakjes geeft het geschatte percentage van de overeenkomstige uitgangspopulatie in dit experiment. A. Initiële gating R1 bevolking verwijdert celaggregatenen cellulaire puin. B. Gate R2 uit R1 omvat de cellen die duidelijk zijn afgebeeld, met uitzondering van de focus cellen. C. Ter119-positieve cellen (van R2) zijn geselecteerd, met uitzondering van cellen die ofwel negatief voor Ter119 zijn of zijn te intensief lood door hun aanwezigheid in aggregaten. D. DNA-positieve cellen (van Ter119-positieve cellen) worden geselecteerd, na plotten voor Aspect Ratio Intensiteit versus intensiteit van de nucleaire vlek (hier Draq5 lezen in kanaal 5). E. DNA-en Ter119-positieve cellen zijn gated in basofiele, polychromatophilic en orthochromatisch erytroblasten op basis van hun locatie in de Ter119 Mean Pixel versus Ter119 Ruimte (hier te lezen in kanaal 3), zoals eerder getoond door McGrath et al. 5. F. De enucleating cellen zijn die cellen uit de orthochromatische erytroblasten, die lage Aspect Ratio (een meting van de cel elongat hebbenion in helderveld (BF) kanaal) en hoge Delta Zwaartepunt XY Ter119/Draq5 (afstand tussen centrum van vorming Ter119 +-reticulocyten en het centrum van de kern). Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al. Signalering en cytoskelet eisen erythroblast enucleatie Blood... 2012;. 119 (25) :6118-6127 door de American Society of Hematology Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger beelden van enucleating erytroblasten met progressief toenemende Delta Zwaartepunt XY Ter119/Draq5. WT muis orthochromatische erytroblasten, gekleurd met Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, en Draq5, zijn gated per hun aspect ratio en delta zwaartepunt XY Ter119/Draq5. Cellen worden getoond vastgesteld op verschillende, opeenvolgende stadia van enucleatie, met een progressie die overeenkomt met afnemende beeldverhouding en toenemende delta zwaartepunt XY Ter119/Draq5 (groen-gele kruis in de poort toont de positie van de cel afgebeeld rechts). In de cel beelden van boven naar beneden, kan F-actine tijdens enucleatie om zich te concentreren op het decollete vore en vervolgens verdwijnen zodra de kern geëxtrudeerd (zoals weergegeven in cel # 4782 bij de lagere afbeelding) in acht worden genomen. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.
Figuur 4. Vorming van een unipolaire microtubuli montage en polarisatie van orthochromatic erytroblasten voorafgaat enucleatie. A. Polarized vorming van microtubuli is zichtbaar in control WT erytroblasten (gekleurd met anti-b-tubuline-AlexaFluor-488 en de nucleaire vlek Draq5), terwijl b-tubuline diffuus is gekleurd in de erytroblasten geïncubeerd met colchicine (5 uM) gedurende 6 uur in de snelle in vitro assay enucleatie. B. multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie kan een kwantitatieve evaluatie van cel polarisatie bieden door analyse van de verdeling van de parameter Delta Zwaartepunt XY BF/Draq5, die de afstand meet tussen het middelpunt van het cellichaam zoals in helderveld en het centrum van de nucleaire kleuring bereikt met Draq5 (schematische voorstelling in de inzet). Delta Zwaartepunt BF/Draq5 waarden van colchicine behandelde WT orthochromatische erythroblasts statistisch significant verschillend van de controle Delta Zwaartepunt BF/Draq5 waarden (p <0,001). Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al. Signalering en cytoskelet eisen erythroblast enucleatie Blood. 2012;. 119 (25) :6118-6127 door de American Society of Hematology Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De laatste jaren onderzoek erytroblast enucleatie heeft opgedaan toenemende momentum omdat het de stap van in vitro erytropoëse culturen die het meest moeilijk efficiënt reproduceren om succesvol grootschalige productie van rode bloedcellen ex vivo te bereiken. Tot voor kort, de studie van erythroblast enucleatie gebruikt voornamelijk fluorescentie microscopie en flowcytometrie methoden. Fluorescentiemicroscopiemethodes, zij nuttig bij het identificeren deelnemende moleculen vereisen dagen microscopische waarneming van een klein aantal orthochromatische erythroblasts ondergaan enucleatie in honderden cellen op een bepaald tijdstip vast te identificeren. Flowcytometrie methoden daarentegen, zijn zeer nuttig is om de snelheid van enucleatie in een cultuur, en de effecten van farmacologische of genetische manipulatie van bepaalde moleculen op het proces, maar geen gegevens over de intracellul geenar lokalisatie van deze moleculen.
Multispectrale beeldvorming flowcytometrie combineert de voordelen van flowcytometrie en immunofluorescentie microscopie aangezien het snelle verwerving van zowel flowcytometrische en morfologische gegevens over enkele duizenden cellen. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van klassieke doorstroomcytometrie in erytropoëse studies, aangezien de verschillende stadia van differentiatie erytroblast (proerythroblasts, basofiele, polychromatophilic en orthochromatisch) is vastgelegd via morfologische criteria 6. Echter, multispectrale beeldvorming flowcytometrie is optimaal voor visualisatie van celstructuren dan kwantificatie vergelijkingen bevolkingsaantallen. Voor dergelijke vergelijkingen, routine stroom-cytometrie dat de permeabilisatie stap die nodig is voor immunofluorescentie van intracellulaire structuren niet nodig beter presteert. Bijvoorbeeld het relatieve percentage van BasoE: Polye: OrthoE in figuur 2E
De beeldgegevens kunnen worden verwerkt in samenhang met de flowcytometrie gegevens met de analysesoftware specifiek voor de beeldvorming flowcytometer, waardoor de verzameling cellen met bepaalde morfologische kenmerken in poorten. Ongeveer honderd enucleating cellen kunnen worden geïdentificeerd in een populatie van 10.000 erytroblasten met de analysemethode beschreven in een snelle en efficiënte manier 7, waardoor meer betekenisvolle observaties en statistische evaluatie.
Bovendien wordt beeldverwerking vergemakkelijkt met de analysesoftware specifiek voor de beeldvorming flowcytometer waardoor kwantitatieve analyse van grootheden zoals de Delta Zwaartepunt XY bestuderen bijvoorbeeld de relatieve positie van de kern naarhet cytoplasma die kan worden gebruikt als een maat van polarisatie.
Kritische stappen in het protocol en het oplossen van problemen
Het is bekend dat zelfs zacht pipetteren kan leiden tot scheiding van reticulocyten en pyrenocyte 12. Dit heeft het potentieel om het aantal gebeurtenissen enucleatie afgebeeld ernstig beperken. Bijgevolg moet erop worden gelet, vooral bij het optillen erythroblasts MS5 gebonden aan cellen in kweek.
Bevestiging met formaldehyde oplossing kan veranderingen veroorzaken extracellulaire regio van oppervlaktemerkers resulteert in verminderde specifieke antilichaambinding en / of verhoogde niet-specifieke antilichaambinding. Een voordeel van het beeldvormende flowcytometer is dat oppervlak kleuring gevisualiseerd en de kwaliteit kan dus worden geëvalueerd. Gestippelde, in plaats van uniforme, kleuring voor overvloedige oppervlakte merkers zoals Ter119 geeft overfixation en moet worden aangepakt door een combinatie van lagere formaldehydehyde concentratie en een kortere duur van de fixatie.
Na fixatie, het houden van cellen op ijs gedurende minstens 15 minuten is van vitaal belang om overtollig cel breuk te voorkomen tijdens het permeabilization proces als gevolg van temperatuurverschillen. Hoewel aceton permeabilisatie handhaaft de fragiele late erythroids beter dan detergens gemedieerde permeabilisatie, wordt de stap waarbij 100% aceton vereist een merkbare, maar niet schadelijk, celverlies. Aan het einde, na wassen met koud FACS buffer, cellen bij kamertemperatuur voor het antilichaam incubatiestappen.
De imaging-stroom heeft cytometer een set debiet (cellen / sec), afhankelijk van de gebruikte lens (tarief wordt verlaagd als de vergroting toeneemt). Na laatste wassing vóór de meting, wordt aanbevolen celpellets worden opnieuw gesuspendeerd in een klein volume (50-60 pi), teneinde de verwerking van het monster te versnellen. Voor een groot aantal monsters die rekatern lange duur van de termijn (meer dan 30 min), moeten monsters worden bewaard op ijs.
De lange-termijn enucleatie test biedt het voordeel van een uitgebreide erythroid productie van cellen om voldoende cellen die voor biochemische evaluatie zoals immunoblotten kan worden verzameld op de enucleatie podium en pull-downs te produceren. De snelle enucleatie test geeft het voordeel van de tijd waarbij slechts 2 dagen uit te voeren, hoewel een muis heeft 4 dagen voor de proef te Phlebotomized. We hebben niet een significant verschil waargenomen in enucleatie efficiëntie tussen de twee methoden. Van de nota, flowcytometrie evaluatie, die de permeabilisatie stap die nodig is voor immunofluorescentie van intracellulaire structuren niet nodig is, zoals eerder beschreven 7, het meest geschikt is voor de kwantitatieve evaluatie van enucleatie efficiëntie.
Beperkingen van de techniek
De hier beschreven methode utilizes biotische erytropoëse in vivo en cultuur in medium met hydrocortison in vitro om erythroide bevolkingsgroepen te versterken en hen te synchroniseren in het stadium van enucleatie. Beide voorwaarden waarschijnlijk imiteren erythroblast-enucleatie onder stress. Bovendien, hydrocortison verhoogt erytroïde opbrengst en overleving. Om gelijkaardige opbrengst van enucleatie gebeurtenissen uit beenmergcellen afkomstig van wild-type muizen met steady-state erythropoiesis en gekweekt zonder hydrocortison (dus het vermijden van synchronisatie) te verkrijgen, zouden we moeten de cultuur cellen van meerdere muizen en rennen en verwerken veel meer evenementen via Multi -Spectral Imaging flowcytometrie. Hoewel multispectrale beeldvorming flowcytometrie versnelt verzamelen van morfologische gegevens enorm in vergelijking met immunofluorescentiemicroscopie behulp vergroting objectief tot maximaal 60x, vergelijking van de verkregen door beeldvorming waarnemingen stromingscytometer met klassieke, Z-stack,en confocale microscopie beelden waardevol betere gegevens te verkrijgen, aangezien de objectieflens in een microscoop vergroting kan geven tot 100x en Z-stack beelden op een 3-dimensionaal beeld van de structuren, die niet haalbaar door beeldvorming flowcytometer dezelfde cel. Het relatief grote aantal soortgelijke cellen in een multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie experiment verzameld, op een willekeurige oriëntatie gedeeltelijk compenseert deze beperking waardoor observaties vanuit een ander gezichtspunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken de Research Doorstroomcytometrie Core in Cincinnati Children's Hospital Research Foundation en Richard Demarco, Sherree vriend, en Scott Mordechai uit de Amnis Corporation (onderdeel van EMD Milllipore) voor deskundige technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent K08HL088126 en R01HL116352 (TAK) en P30 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
