Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess.
Abstract
Erythropoese bei Säugetieren schließt mit der dramatischen Prozess der Entkernung, die in Retikulozyten-Bildung führt. Der Mechanismus der Enukleation ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ein gemeinsames Problem, das bei der Untersuchung der Lokalisation von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten durch Mikroskopie ist die Schwierigkeit, eine ausreichende Anzahl von Zellen, die eine Enukleation beobachten. Wir haben eine neue Analyse-Protokoll mit Multi High-Speed-Cell-Imaging in Strom (Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie), eine Methode, die Immunfluoreszenz-Mikroskopie kombiniert mit Durchflusszytometrie, um effizient eine erhebliche Anzahl von enucleating Ereignisse zu identifizieren entwickelt, die erlaubt zu erhalten, Messungen und statistische Analysen.
Wir beschreiben hier zunächst zwei in-vitro-Kultur, um die Erythropoese verwendet, um Maus Erythroblasten synchronisieren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erfassung Enukleation bei th Methodene Zeit der Auswertung. Dann beschreiben wir im Detail die Färbung von Erythroblasten nach Fixierung und Permeabilisierung, um die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen oder Lipidflößen in Enukleation durch multispektrale Abbildungs Durchflusszytometrie studieren. Neben Größe und DNA/Ter119 Färbung, die verwendet werden, um die orthochromatischen Erythroblasten zu identifizieren, nutzen wir die Parameter "Seitenverhältnis" einer Zelle, in der Hellfeld-Kanal, der in der Anerkennung des langgestreckten Zellen und "delta Schwerpunkt XY Ter119/Draq5 hilft "ermöglicht, daß die Identifizierung der zellulären Ereignisse, bei denen das Zentrum der TER119-Färbung (naszierenden Retikulozyten) weit von der Mitte der DRAQ5 Färbung (Kern zogen Extrusion), was auf eine Zelle, die enucleate. Die Teilmenge der orthochromatischen Erythroblasten Bevölkerung mit qualitativ Delta Schwerpunkt und niedrigem Aspektverhältnis ist sehr in enucleating Zellen angereichert.
Introduction
Terminalen Differenzierung innerhalb der erythroiden Abstammungslinie in Säugern schließt mit der drastisch Prozess der Enukleation, durch die der orthochromatischen Erythroblasten treibt seine Membran umhüllten Kern (pyrenocyte) 1, Erzeugen eines Retikulozyten-2. Der genaue Mechanismus dieses Prozesses, der auch der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für eine erfolgreiche, große Produktion von roten Blutzellen in vitro, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Lokalisierung von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten beruht auf der Verwendung von Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie 3-5. Dieser langwierige Prozess führt typischerweise zur Festlegung einer begrenzten Anzahl von Ereignissen Enukleation und erlaubt nicht immer sinn statistischen Analyse. Aufbauend auf ein Verfahren zur Identifizierung Erythroblast zuvor von McGrath et al. 6 beschrieben, haben wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung und Untersuchung Enukleation Veranstaltungen von Multi-Spectral Ima entwickeltGing Durchflusszytometrie (Multi High-Speed-Cell-Imaging in Flow, eine Methode, die Fluoreszenzmikroskopie mit Durchflusszytometrie kombiniert) 7, die eine ausreichende Anzahl von Beobachtungen liefern können, um Messungen zu erhalten und statistische Analysen.
Hier beschreiben wir zwei ersten in vitro Erythropoese Kultur, um Erythroblasten synchronisieren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erfassung Enukleation bei der Auswertung verwendeten Methoden. Dann beschreiben wir im Detail die Färbung von Erythroblasten nach Fixierung und Permeabilisierung, um die Lokalisierung der intrazellulären Proteinen oder Lipid-Rafts während Enukleation durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie studieren.
Die Proben werden auf einer Bild Durchflusszytometer laufen und die gesammelten Zellen angemessen zu orthochromatischen Erythroblasten gated 6 identifizieren. Orthochromatischen Erythroblasten werden dann auf der Basis des Seitenverhältnisses untersucht, wie im Hell ima gemessenGing, gegen deren Wert für den Parameter Delta Zentroid XY TER119-DNA, die als Abstand zwischen den Mittelpunkten der Bereiche für TER119 und DNA angefärbt bzw. definiert ist. Die Population von Zellen mit niedrigen Seitenverhältnis und hohe Delta-Schwerpunkts XY Ter119/DNA ist hoch in enucleating Zellen angereichert. Mit Wildtyp (WT) Erythroblasten gegenüber Erythroblasten mit Mx-Cre vermittelte bedingte Löschung Rac1 auf Rac2 - / - oder kombiniert Rac2 - / -; RAC3 - / - genetischen Hintergrund und das neue Analyse-Protokoll des multispektralen Bildgebung Durchflusszytometrie, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Enukleation ähnelt asymmetrische Zellteilung und die Bildung einer Actomyosin Ring teilweise durch Rac GTPasen geregelt ist wichtig für die Enukleation Progression 7.
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Protocol
1. Langzeit-In-vitro-Kultur Erythropoese (Ex-vivo-Differenzierung Erythroide Kultur-Protokolls durch Giarratana et al. 8, modifiziert und für Mouse Cells Angepasst)
Dies ist ein 3-Schritt-Langzeit-in-vitro Erythropoese-Protokoll. Im ersten Schritt (Tag 0-4) 2 x 10 5 Zellen / ml in Wachstumsmedium Erythroblasten mit Stammzellfaktor (SCF), Interleukin-3 (IL-3), Erythropoietin (Epo) ergänzt platziert. Im zweiten Schritt (Tage 5-6), werden die Zellen mit 2 × 10 5 Zellen resuspendiert / ml und co-kultiviert auf adhärenten Stromazellen (MS5) in frischem Wachstumsmedium nur Erythroblasten mit Epo supplementiert. Im dritten Schritt (Tage 7-9), sind Zellen, die auf einer Schicht von MS-5-Zellen in frischem Wachstumsmedium ohne Erythroblasten Cytokine bis zu Enukleation (1A) kultiviert.
Alle Tier Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der zugelassenenCincinnati Children s Hospital Medical Center.
- Ernte von Knochen und Isolierung von Low-Density-Knochenmarkzellen
- 2 ml sterile IMDM mit 2% fetales Rinderserum (FBS) in einem 15 ml konischen Röhrchen und auf Eis zu halten.
- Euthanize einen 2-6 Monate alten Wildtyp-Maus C57/BL6 (zusammen mit oder ohne gentechnisch gezielt Maus von Interesse) folgende Institutionen genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation, gefolgt durch Genickbruch).
- Isolieren Beckenknochen, Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen und beider Beine mit Pinzette und Skalpell, fügen sie dem Röhrchen mit IMDM + 2% FBS und auf Eis zu halten.
- 1 ml IMDM + 2% FBS in einer sterilen Durchflusszytometrie Rohr und bündig Knochen mit einer Pinzette und eine Tuberkulin-Spritze mit einer 25-G x 5/8 "-Nadel. Flush IMDM + 2% FBS durch die Knochen ein paar Mal sanft ( durch Ansaugen von ~ 500 &mgr; l aus der Zellsuspension und erneut Spülen durch den Knochen) und Sammeln der Knochenmarkzellen in den Strom-cytometry Rohr. Flushing ist beendet, wenn die Knochen weiß erscheinen.
- Filterzellensuspension durch ein 40 &mgr; m-Zellsieb Satz auf einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschzelle Sieb mit IMDM + 2% FBS und mit dem gleichen Medium einzustellen Endvolumen der Zellsuspension in 5 ml.
- Bereiten niedriger Dichte Knochenmarkzellen (LDBM) durch Dichtegradientenzentrifugation: sorgfältig die Schicht 5 ml Zellsuspension auf 5 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium 1,083 g / ml in einen 15-ml-Tube und Spin bei 750 g für 25 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Bremse / niedriger Beschleunigung.
- Überstand (alles bis zu der 2-ml-Marke des 15-ml-Tube, um Buffy-Coat erwerben) in ein neues 15-ml-Tube und führen Sie eine weitere Wäsche mit IMDM + 2% FBS bei 525 g für 5 min bei RT.
- Überstand wird abgesaugt und lysieren die verbleibenden roten Blutzellen (RBC) durch Suspendieren des Pellets in 3 ml RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT. Wenn eine größere Reinheit der Erythroblasten istin der letzten Stufe (zB für biochemische Untersuchungen) erforderlich ist, zu reinigen LDBM Zellen weiter bei diesem Schritt Lin neg Zellen durch magnetische Trennung.
- Ex vivo erythroide Differenzierung Kultur Protokoll ab LDBM oder Lin neg Zellen (Fig. 1A)
- 7 hinzuzufügen ml IMDM + 2% FBS, Schleudern bei 525 × g für 5 min bei RT und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 2 ml Erythroblasten-Wachstumsmedium (EGM), bestehend aus:
ein. StemPro-34-Medium, das
b. 2,6% StemPro-34-Medium zu ergänzen,
c. 20% BIT-9500,
d. 900 ng / ml Eisensulfat,
E. 90 ng / ml Eisennitrat,
f. 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin
g. 10 &supmin; &sup6; M Hydrocortison
h. und frisch zuge Zytokine:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) 5 ng / ml IL-3, und
iii) 3 IU / ml Epo. - Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder manuell an ein Mikroskop mit einem Saumocytometer.
- Platte in einer 6-Well-Zellkulturplatte in einer Konzentration von 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung auf ein Endvolumen von 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 LDBM Zellen / ml) und Inkubation bei 37 ° C (dies wird als als Tag der Kultur # 0).
- Änderungsmedium durch Absaugen 1,5 ml des Überstandes, Schleudern bei 525 × g für 5 min bei RT, resuspendiert in 1,5 ml frisches Medium, das alle 3 Zytokine und Zugabe täglich zurück in die Vertiefungen an den Tagen Nr. 2, 3, 4, zu optimieren Proliferationsphase. Am Tag 3, entfernen Sie alle Zellen zählen und aufgeteilt in entsprechende Anzahl von Brunnen, um gut zu Zellkonzentrationen von ~ 2 x 10 5 Zellen / ml zu erhalten. Aufrechterhaltung bei 37 C / 5% CO 2 °.
- Am Tag 4 Platte MS5 Zellen (Maus-Stroma-Zelllinie) in die Vertiefungen einer neuen Zellkultur-6-Well-Platte. Die MS5 Zellkulturmedium wird α-MEM mit 20% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
- Am Tag 5 zählen Anzahl derZellen (jetzt deutlich in Erythroblasten angereichert) in jede Vertiefung der ursprünglichen Kulturplatte mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder manuell bei einem Mikroskop mit einer Zählkammer.
- Heben Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung und Transfer zum 15-ml konische Röhrchen, drehen bei 525 xg unten für 5 min bei RT, absaugen Überstand und Pellets lösen sich mit frischen EGM, die nur Epo (3 IU / ml) zu einer Konzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml.
- Absaugen des Überstandes von den Brunnen, wo MS-5-Zellen wurden am Tag zuvor (zu 70-80% Konfluenz bei der Co-Kultur gezielte) plattiert und fügen Sie die erythroiden Zellen in diesen Brunnen in EGM, die nur Epo (wenn auch nicht das Medium ihrer Wahl, MS-5-Zellen überleben auch in EGM über mehrere Tage).
- Ändern Zugabe von frischem Medium EPA am Tag # 6.
- Ändern Medium an Tag # 7, mit EGM ohne Zusatz von Zytokinen. An den Tagen 7 bis 9, Prüfmuster für Enukleation mit Durchflusszytometrie nach Färbung mit anti-TER119 und Syto 16-Tages-und proceed der Färbung Proben für Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (wie in Abschnitt 3 beschrieben).
Hinweis:. Vor der Beschichtung und an Tag 2, 4, 6, und 7 der Kultur, überwachen kultivierten Zellen für Erythroblast Bereicherung und Differenzierung mit Durchflusszytometrie durch die Beurteilung Oberflächenmarker CD44 und TER119 vs Größe (FSC) 9 Alternativ CD71, TER119 und FSC kann auch 10, 11 werden.
- 7 hinzuzufügen ml IMDM + 2% FBS, Schleudern bei 525 × g für 5 min bei RT und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 2 ml Erythroblasten-Wachstumsmedium (EGM), bestehend aus:
2. Schneller Enukleation Assay, Nach dem Protokoll von Yoshida et al. Änderungen mit 12 (Abbildung 1B)
- Stress-Erythropoese Induktion und Stroma Zellpräparat zur in-vitro-Kultur Erythropoese
- Anesthetize einen 2-6 Monate alten Wildtyp-Maus C57/BL6 pro IACUC Richtlinien (zB mit Isofluran Lösung). Stellen Sie sicher, dass die Maus wurde ausreichend durch Prüfung auf Abwesenheit von reflexive Reaktionen auf eine sanfte Hinterpfote Prise und betäubtnormale Atmung während der Prozedur. Verwenden Tierarzt Augensalbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
- Stress ausgelöst werden Erythropoese über Schwanz Blutungen auf ein Gesamtvolumen von 500 ul. Verwendung eines Insulin-Spritze gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal Flüssigkeitszufuhr von dem Tier (Tier halten in Trendelenburg-Position vor der Injektion und Injektion in den Unterleib, um nicht innere Organe zu beschädigen) sicherzustellen.
- Die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder wie Motorsteuerung durch das Tier angedeutet beginnen, um den Käfig zu bewegen und in der Lage zu stehen und zu gehen, ohne zu fallen. Die Phlebotomized Maus in einem Käfig ohne andere Mäuse platziert.
- Nach 2 Tagen wurde die Platte MS-5-Zellen in Vertiefungen einer 24-well-Zellkulturplatte. Inkubieren MS-5-Zellen bei 37 ° C / 5% CO 2 in Zellmedium MS5 (a-MEM mit 20% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) mit dem Ziel, 70-80 sein % konfluent in Plattenvertiefungen nach 48 Stunden.
- Ernte der Milz und Verarbeitung von Splenozyten
- Vier Tage (96 Stunden) nach Stress Erythropoese Induktion, einschläfern vorher durch IACUC genehmigten Protokoll (zB CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte) blutete Maus.
- Ernte Milz und steckte es in einen 15-ml konischen Röhrchen enthält IMDM 2% FBS und auf Eis zu halten.
- Zurück im Labor, in der Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen, invertieren Milz haltige Rohr auf einem 40-um-Zellsieb auf einem 50-ml-Tube eingestellt. Crush Milz mit dem Kolben einer 5-ml-Plastikspritze.
- Waschzelle Sieb mit IMDM + 2% FBS und mit dem gleichen Medium, Einstellen des Endvolumens der Zellsuspension in 5 ml.
- Vorsichtig Schicht die 5 ml Suspension Splenozyten auf 5 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium 1,083 g / ml in einen 15-ml-Tube und Spin bei 750 g für 25 min bei RT ohne Bremse / low Beschleunigung.
- ÜberweisungÜberstand (Lösung auf etwa 2-ml-Marke des 15-ml-Tube, um Buffy-Coat erwerben) in ein neues 15-ml-Tube und führen Sie eine weitere Wäsche mit IMDM + 2% FBS bei 525 g für 5 min bei RT .
- Überstand wird abgesaugt und die Lyse der roten Blutzellen durch Suspendieren des Pellets in 3 ml RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT.
- 7 ml IMDM + 2% FBS zu den Zellen zu waschen und zu verdünnen und neutralisieren die RBC-Lyse-Puffer und Schleudern bei 525 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand wird abgesaugt und pelletiert Zellen aussetzen in 2 ml Erythroblast Wachstumsmedium (EGM).
- Kultur der isolierten niedriger Dichte Splenozyten in Erythroblasten angereichert, auf Kunststoff (erste Stufe des schnellen in vitro Erythropoese Kultur)
- Zählen von Zellen an einem automatisierten Zellzähler oder manuell mit einem Hämozytometer. Übliche Anzahl von Zellen pro Milz isoliert in dieser Phase ist ~ 15 x 10 6.
- Suspend-Zellen weiter in EGM, die die Zytokine (bei final Konzentrationen): SCF 50 ng / ml IL-3 5 ng / ml, und Epo 2 U / ml.
- Platte 1-5 x 10 6 Zellen in einem Endvolumen von 1 ml / well (gleiche Anzahl von Zellen pro Vertiefung je Gesamtzahl der Zellen) einer 24-Well-Zellkultur-Platte und Inkubation O / N bei 37 ° C / 5% CO 2.
- Kultur von Erythroblasten auf MS5 Zellen (zweite Stufe des schnellen in vitro Erythropoese Kultur
- Absaugen des Überstandes aus dem Kunststoff gut und heben die Zellen (in Erythroblasten hochangereichertes) durch Zugabe von 2 ml kaltem 10 mM EDTA in PBS für 5 min auf Eis zu jeder Vertiefung.
- Setzen Zellen in frische Röhrchen, einmal in EGM waschen (ohne Zytokine) und resuspendieren in der gleichen.
- Platte 5 × 10 5 -1 × 10 6 Zellen in einer 1-2 ml Volumen jeder Zelle MS5 beschichteten Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wenn pharmakologische Inhibitoren werden in dem Experiment verwendet, fügen Sie sie in geeigneten Konzentrationen jetzt.
- Inkubation für 6 bis 8 h (Zeit geführtmikroskopische Beobachtung von etwa 30% -40% Enukleation in der unbehandelten Probe WT). Die Bindung von Erythroblasten zu MS-5-Zellen beschleunigt die Enukleation.
- Heben Zellen aus jeder Vertiefung durch Zugabe von 2 ml kaltem PBS + 10 mM EDTA, 5 min auf Eis. Zusammen mit den Erythroblasten, wird MS-5-Zellen auch gesammelt werden, aber diese können später leicht während Durchflusszytometrieanalyse FSC hallo TER119 ausgeschlossen werden - Zellen.
- In diesem Stadium können die Zellen fixiert und gefärbt werden, zur Analyse durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie.
3. Färbung der Erythroblasten für die Lokalisierung von intrazellulären Proteinen oder Lipid Rafts Während Enukleation von Multi-spektrale Imaging Durchflusszytometrie
- Waschen der Zellen in PBS, Spin 525 × g für 5 min bei RT und Absaugen des Überstandes.
- Fix Zellen durch Resuspendieren Zellpellets in 500 &mgr; l 3,7% Formaldehyd in PBS für 15 min (Fixierungszeit je nach anti variierengen, die geprüft wird) und Pipettieren sanft.
- Übertragen auf 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen und Inkubation für 15 min bei RT.
- Spin auf einer Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, Stand absaugen und führen Sie eine Wasch durch Zugabe von 500 ul PBS in jedes Röhrchen und Pipettieren sanft.
- Spin auf einer Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und halten Röhrchen auf Eis für mindestens 15 min. Permeabilisierung Schritte 3,6-3,9 sollte schnell und effizient durchgeführt werden und nach Spinn / Aspiration bei RT Zellpellets sofort wieder auf Eis gelegt werden, um für die Zellen, um besser ihre Integrität behalten.
- Nehmen Aceton-Lösungen aus -20 ° C Gefrierschrank und setzen auf Eis. Durchdringbar Zellen durch Resuspendieren Zellpellets zuerst in 500 ul eiskaltem 50% igem Aceton (1:1 mit dH 2 O) und Pipettieren schonend.
- Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren Zellpellets in 500 ul60; eiskaltem 100% Aceton durch Pipettieren vorsichtig.
- Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren Zellpellets noch einmal in 500 ul eiskaltem 50% Aceton durch Pipettieren vorsichtig.
- Spin auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, Stand absaugen und waschen die Zellen einmal in kaltem FACS-Puffer (PBS + 0,5% BSA) durch Pipettieren vorsichtig.
- Bereiten Kennzeichnung Cocktail mit Antikörpern oder Marker für die Moleküle von Interesse: 0.1 U/100 ul AF488-Phalloidin für F-Actin-Färbung und ein μl/100 ul TER119-PECy7 für erythroiden Zellfärbung. Alternative oder zusätzliche Färbung kann auch mit AF-488-Anti-β-Tubulin-Antikörper (1:50), AF-594-konjugierten Choleratoxin-Untereinheit B der Lipidflöße kenn (1:200), anti-pMRLC (Ser19) durchgeführt werden Primäre Antikörper für das phosphorylierte Myosin regulatorische leichte Kette (1:50), gefolgt von anti-Kaninchen-AF-488-konjugierten sekundären Antikörper (1:400) und anti-γ-rohrlin primären Kaninchen-Antikörper (1:100), gefolgt von anti-Kaninchen-AF-555-konjugierten sekundären Antikörper (1:300).
- Nach der Überstand Aspiration, resuspendieren Zellpellets in 100 ul des Markers Cocktail, Pipetten sanft und Inkubation für 30 min bei RT.
- Bereiten FACS-Puffer mit 2,5 uM der Kernfärbung DRAQ5.
- Waschen der Zellen in FACS-Puffer, Spin-down auf der Bank Mikro 2.000 g für 20 sec, absaugen Überstand und resuspendieren in 60 ul FACS-Puffer mit DRAQ5.
- Proben laufen auf der Abbildungs Durchflusszytometer mindestens 10.000 Ereignisse pro Experiment sammeln, kompensieren die Rohdaten, wie zuvor veröffentlicht 13, und wie in Fig. 2 gezeigt Ergebnisse analysieren, unter Verwendung der Analyse-Software spezifische Abbildungs Durchflusszytometer.
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Representative Results
Zunächst werden die Zellen auf der Basis ihrer Hellseitenverhältnis (das Verhältnis der Länge der kleineren gegen ihre Hauptachse) und ihre Hellbereich (Durch ihrer Größe) analysiert. Ereignisse mit einem Hellbereich-Wert niedriger als 20 und mehr als 200 sind meist Trümmer und Zellaggregate sind, und werden aus der Analyse (2A) ausgeschlossen. Einzelne Zellen (Gate "R1") sind dann basierend auf ihren Wert für den Parameter Gradient RMS, die Schärfe des Bildes zeigt analysiert. Gate "R2" wird enthaltenden Zellen mit Gradient RMS-Wert mehr als die 50-Perzentil, um die Bilder auch im Fokus (2B) genommen wählen erstellt. Die Zellen werden dann auf der Basis ihrer Größe gated wie durch ihre Hellraum gemessen und ihre Positivität für die erythroiden Marker TER119 wie von der TER119 fluoreszierenden Fleck Parameter-Mittelwert gemessen Pixel (Gate "TER119 positiv", 2C). Zellen sehr gering oder sehr hoch für TER119, sind entweder nicht erythroids oder Restzellaggregate sind, und werden von der Analyse ausgeschlossen. Im nächsten Schritt werden die Zellen auf der Basis ihrer DRAQ5 Seitenverhältnis Intensität (das Verhältnis der Nebenachse gegenüber dem großen Intensität der Kern) und der Intensität des DRAQ5 (Fig. 2D) ausgewählt wird. DRAQ5 negativen Zellen (meist entkernte Zellen, wie Retikulozyten und Erythrozyten) und die Zellen mit einem niedrigen DRAQ5 Seitenverhältnis (meist Dubletten) werden aus der Analyse ausgeschlossen. DRAQ5 positiven Zellen (Gate "-DNA-positiv", meist Erythroblasten an dieser Stelle) werden dann auf der Grundlage ihrer TER119 Bereich, der die Größe der Zelle und ihre TER119 Mittlere Pixel / Bereich (Dichte der TER119 Ausdruck), zeigt an, welche angibt, analysiert die Helligkeit TER119 Färbung. Orthochromatischer Erythroblasten (Gate "OrthoE"), werden als kleine, TER119 hallo Zellen (2E) anerkannt. Schließlich wird eine Subpopulation der orthochromatic Erythroblasten in enucleating Zellen hochangereichertes wird durch niedrige Hellseitenverhältnis, das eine Messung der Zellstreckung, durch das Verhältnis der Nebenachse / Hauptachse der Zelle Bild in der Hellkanal M01, und durch hohe Delta Centroid XY TER119 berechnet wird, ist gekennzeichnet / DRAQ5, die durch den Abstand zwischen der Mitte des beginn + TER119-Retikulozyten und der Mitte des DRAQ5 +-Kern (gate "enucleating Zellen" in Fig. 2F) definiert ist.
Sowie Antikörper gegen TER119 und die DNA-Flecken DRAQ5, die Zellen wurden auch für filamentösen Aktin (F-Aktin) mit fluoreszierendem Phalloidin gefärbt, um die Lokalisierung des F-Actin in Erythroblasten Enukleation 7 auszuwerten. Zu beachten ist, kann ein Fortschreiten der Enukleation in den fixierten Zellen sichtbar gemacht werden, wie Zellen mit abnehmender Seitenverhältnis (zB zunehmend gedehnt) und die Erhöhung Delta-Schwerpunkts XY Ter119/Draq5 beobachtet werden (Abb.Abbildung 3). F-Aktin beobachtet am Teilungsfurche während Enukleation konzentrieren und dann abzuleiten, wenn der Kern extrudiert. Darüber hinaus können Co-Lokalisation von Aktin und Myosin an der Spaltfurche zwischen beginnenden Retikulozyten-und Kern durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie nach Ko-Färbung von WT Erythroblasten für pMRLC (phosphoryliert Myosin regulatorische leichte Kette) und F-Actin-7 nachgewiesen werden.
Andere Proteine und Strukturen von Interesse kann auch mit entsprechenden Antikörpern oder Fluoreszenzmarkern angefärbt werden, um bildgebende Studien ihrer Rolle während der Enukleation ermöglichen. Polarisierte Mikrotubulus-Bildung ist in WT orthochromatischen Erythroblasten vor Enukleation aber nicht in Erythroblasten mit Colchicin (4A) behandelt sichtbar. Die Hemmung der Tubulin-Polymerisation durch Colchicin verringert Zellpolarisation, wie durch die Messung der Parameter Delta-Schwerpunkts XY BF/Draq5 zwischen der CEN nachgewiesenter des Zellkörpers in Hell Kanal und dem Zentrum der Kernfärbung mit DRAQ5 (4B) erreicht gesehen.
Mit Hilfe WT oder Rac-Mangel (nach genetischen oder pharmakologischen Manipulation) Erythroblasten in multispektralen Bildgebung Durchflusszytometrie erlaubt Imaging-Studien, die die Rolle von Rac GTPasen in Enukleation demonstrieren. Rac GTPasen regulieren zumindest teilweise die Bildung einer Actomyosin Ring sowie den Zusammenfluss von Lipid-Rafts in der Furche zwischen beginnenden Retikulozyten-und pyrenocyte 7.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Erythropoese in vitro-Protokolle, um enucleating Erythroblasten für Studien zu produzieren. A. Langzeit-in-vitro-Kultur Erythropoese initiated von LDBM oder Lin -.. Zellen B. Schnelle Enukleation Assay durch Splenozyten nach Stress Erythropoese-Induktion in vivo durch Aderlass hoch in Erythroblasten angereichert initiiert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Analyse von Daten unter Verwendung der Analyse-Software spezifische Abbildungs Durchflusszytometer. Aufeinander Gating der Populationen von Interesse in Platten AF gezeigt. Die Zahl in Klammern gibt die ungefähre Prozent des entsprechenden Grundgesamtheit, die in diesem Experiment. A. Anfängliche Gating R1 Population entfernt Zellaggregatenund Zelltrümmer. B. Tor von R1 R2 enthält die Zellen, die deutlich abgebildet haben, ohne unscharf Zellen. TER119 C-positiven Zellen (von R2) ausgewählt werden, ohne Zellen, die entweder negativ für TER119 sind oder zu intensiv gefärbten wegen ihrer Präsenz in Aggregate. D. DNA-positiven Zellen (von TER119-positive Zellen) ausgewählt werden, nach dem Plotten für Seitenverhältnis Intensität gegenüber der Intensität der Kernfärbung (hier DRAQ5 in Kanal gelesen 5). E. DNA-und TER119-positiven Zellen in basophilen, polychromatophilic und orthochromatischen Erythroblasten basierend auf ihrem Standort in der TER119 Mittlere Pixel gegenüber TER119 Umgebung gated (hier im Kanal gelesen 3), die zuvor von McGrath et al 5 dargestellt. F. Die enucleating Zellen sind jene Zellen, aus den orthochromatischen Erythroblasten, die niedrigen Seitenverhältnis (eine Messung der Zell längliche habenIonen im Hell (BF)-Kanal) und eine hohe Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (Abstand zwischen Mitte der Bildung TER119 +-Retikulozyten und Zentrum des Kerns). Diese Arbeit wurde ursprünglich in Blood veröffentlicht: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Signalisierung und Zytoskelett-Anforderungen in Erythroblast Enukleation Blut... 2012;. 119 (25) :6118-6127 von der American Society of Hematology Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Bilder der enucleating Erythroblasten mit progressiv ansteigenden Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT Maus orthochromatischen Erythroblasten mit TER119-PECy7, Phalloidin-AF488 und D gebeiztraq5 werden nach ihren Seitenverhältnis und die Delta-Schwerpunkts XY Ter119/Draq5 verknüpft. Zellen fixiert zu verschiedenen, aufeinanderfolgenden Stufen der Enukleation gezeigt, mit einer Progression, die abnehmende Längenverhältnis und die Erhöhung delta Zentroid XY Ter119/Draq5 entspricht (grün-gelb im Quer Gate zeigt die Position der Zelle auf der rechten Seite abgebildet). In den Zell Bilder von oben nach unten, kann F-Aktin während der Entkernung an der Teilungsfurche konzentrieren und dann abführen, wenn der Kern (am unteren Bild wie in Zelle # 4782 gezeigt) extrudiert beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine zu sehen Größere Version der Figur.
4. Bildung einer unipolaren Mikrotubuli und Polarisation orthochromatic Erythroblasten voraus Enukleation. A. Polarisierte Mikrotubuli-Bildung ist sichtbar in der Steuerung WT Erythroblasten (mit Anti-b-Tubulin-AlexaFluor-488 und dem Kernfärbung DRAQ5 gefärbt), während b-Tubulin diffus in den Erythroblasten mit Colchicin (5 uM) für 6 Stunden inkubiert gebeizt in der schnellen In-vitro-Assay Enukleation. B. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie eine quantitative Auswertung der Zellpolarisation bieten durch eine Analyse der Verteilung der Parameter Delta Centroid XY BF/Draq5, die den Abstand zwischen der Mitte des Zellkörpers misst wie in Hellfeld-und der Mitte der Kernfärbung mit DRAQ5 (schematische Darstellung im Kasten) erreicht gesehen. Delta Centroid BF/Draq5 Werte von Colchicin behandelten WT orthochromatischen Erythroblasten sind statistisch signifikant von der Kontrolle Delta Centroid BF/Draq5 Werte (p <0,001). Diese Arbeit wurde ursprünglich in Bloo veröffentlichtd:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Signalisierung und Zytoskelett-Anforderungen in Erythroblast Enukleation Blut. 2012;. 119 (25) :6118-6127 von der American Society of Hematology Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In den letzten Jahren das Studium der Erythroblasten Enukleation zunehmend an Dynamik gewonnen, da ist der Schritt in die Erythropoese in vitro-Kulturen, die am schwierigsten ist es, effizient, um erfolgreiche, groß angelegte Produktion von roten Blutzellen ex vivo zu erreichen reproduzieren. Bis vor kurzem war die Untersuchung von Erythroblasten Enukleation verwendet hauptsächlich Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden. Fluoreszenzmikroskopieverfahren, wenn auch hilfreich bei der Ermittlung beteiligten Moleküle benötigen Tagen mikroskopische Beobachtung, um eine kleine Anzahl von orthochromatischen Erythroblasten zogen Enukleation innerhalb Hunderte von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt fest identifizieren. Durchflusszytometrie Methoden, auf der anderen Seite, sind sehr nützlich bei der Beurteilung der Geschwindigkeit der Enukleation in einer Kultur, wie auch die Wirkungen von pharmakologischen und genetischen Manipulation von bestimmten Molekülen auf diesen Prozess, aber keine Daten auf dem intracellul keinear Lokalisierung dieser Moleküle.
Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie kombiniert die Vorteile der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Mikroskopie, da es eine schnelle Erfassung von sowohl durchflusszytometrischen und morphologischen Daten auf mehrere tausend Zellen. Dies ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber klassischen Durchflusszytometrie in Erythropoese-Studien, da die verschiedenen Stadien der Differenzierung Erythroblasten (Proerythroblasten, basophilen, polychromatophilic und orthochromatischen) wurden anhand morphologischer Kriterien 6 definiert. Allerdings ist multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie optimal für die Visualisierung von Zellstrukturen, nicht einen relativen Quantifizierung Vergleiche in Bevölkerungszahlen. Für solche Vergleiche, Routine Durchflusszytometrie, die nicht die notwendige Permeabilisierung Schritt für Immunfluoreszenz von intrazellulären Strukturen erfordert eine bessere Leistung. Zum Beispiel der relative Anteil der BasoE: PolyE: OrthoE in 2E
Die Bilddaten können in Verbindung mit der Durchflusszytometrie Daten unter Verwendung der Analyse-Software spezifische Abbildungs Durchflusszytometer, so dass die Sammlung von Zellen mit bestimmten morphologischen Eigenschaften innerhalb Gatter verarbeitet werden. Rund hundert enucleating Zellen innerhalb einer Population von 10.000 Erythroblasten mit der oben in einer schnellen und effizienten Weise 7 beschriebenen Analyseverfahren identifiziert werden, so dass mehr sinnvolle Beobachtungen und statistische Auswertung.
Darüber hinaus wird die Bildverarbeitung mit der Analysesoftware speziell für die Bildgebung Durchflusszytometer erlauben quantitative Analyse solcher Eigenschaften wie der Delta Centroid XY zB der relativen Position des Kerns zu studieren erleichtertdas Zytoplasma, die als Maß für die Polarisation verwendet werden kann.
Kritische Schritte in der Protokoll-und Fehlersuche
Es ist bekannt, dass selbst vorsichtiges Pipettieren kann bei der Trennung von Retikulozyten und pyrenocyte 12 führen. Dies hat das Potential, die Anzahl der Enukleation Ereignisse abgebildet stark einschränken. Als Ergebnis muss darauf geachtet werden, insbesondere beim Anheben Erythroblasten bis MS5 Zellen in Kultur gebunden ist.
Fixierung mit Formaldehyd-Lösung können Änderungen an extrazellulären Regionen von Oberflächenmarkern was zu einer verringerten spezifischen Antikörperbindung und / oder eine erhöhte nicht-spezifische Antikörperbindung zu bewirken. Ein Vorteil der Abbildungs Durchflusszytometer ist, dass Oberflächenfärbung sichtbar gemacht und seine Qualität kann somit beurteilt werden. Gepunktete statt Uniform, Färbung für reichlich Oberflächenmarker wie TER119 zeigt overfixation und sollte durch einen Mix aus niedrigeren Formaldehyd in Angriff genommen werdenhyde Konzentration und kürzere Dauer der Fixierung.
Nach der Fixierung halten Zellen auf Eis für mindestens 15 Minuten ist, um überschüssige Zellbruch während der Verfahren zur Permeabilisierung durch Temperaturunterschiede zu verhindern, wichtig. Obwohl Aceton Permeabilisierung pflegt die empfindliche spät erythroids besser als Waschmittel-vermittelten Permeabilisierung, wird der Schritt, in dem 100% Aceton ist erforderlich, in einem auffällig, aber nicht schädlich, Verlust von Zellen führen. Am Ende, nach einer Wäsche mit kaltem FACS-Puffer werden die Zellen bei Raumtemperatur für die Antikörper-Inkubationen erlaubt.
Die Bildfluss hat Durchflusszytometer eine Reihe von Durchflussrate (Zellen / sec), je nach dem verwendeten Objektiv (Rate wird mit zunehmender Vergrößerung vermindert). Nach der letzten Wäsche vor der Messung, wird empfohlen, dass die Zellpellets werden in einem kleinen Volumen (50-60 &mgr; l) resuspendiert, um die Verarbeitung der Probe zu beschleunigen. Für eine große Anzahl von Proben, die wiederQuire lange Dauer der Lauf (über 30 min), sollten die Proben auf Eis gehalten werden.
Die langfristige Enukleation Test bietet den Vorteil eines erweiterten erythroiden Zellproduktion um genug Zellen, die an der Enukleation Bühne für biochemische Auswertung wie Immunoblotting gesammelt werden können und Pull-Downs zu produzieren. Die schnelle Enukleation Assay gibt den Nutzen der Zeit erfordern nur 2 Tage durchzuführen, obwohl eine Maus braucht bis 4 Tage vor dem Experiment Phlebotomized werden. Wir haben keinen signifikanten Unterschied in der Enukleation Effizienz zwischen den beiden Methoden beobachtet. Zettel, Durchflusszytometrie Bewertung, die nicht die Permeabilisierung Schritt für Immunfluoreszenz von intrazellulären Strukturen notwendig erfordert, wie vorher 7 beschrieben, ist für die quantitative Auswertung der Blasenbildungseffizienz am besten geeignet.
Grenzen der Technik
Die hier beschriebene Methode utiLizes induzierten Stress Erythropoese in vivo und Kultur in Medium mit Hydrocortison in vitro, um Erythrozyten-Populationen verstärken und in der Phase der Entkernung synchronisieren. Beide Bedingungen wahrscheinlich imitieren Erythroblast-Enukleation unter Stress. Zusätzlich Hydro erhöht erythroiden Ausbeute und Überleben. Um eine ähnliche Ausbeute von Enukleation Ereignisse aus Knochenmarkszellen aus Wildtyp-Mäusen, die mit stationären Erythropoese und kultiviert ohne Hydrocortison (daher die Vermeidung Synchronisation) abgeleitet zu erhalten, würden wir zur Kultivierung von Zellen aus mehreren Mäusen müssen und laufen und verarbeiten viel mehr Ereignisse durch Multi Spectral Imaging-Durchflusszytometrie. Obwohl multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie beschleunigt Sammlung von morphologischen Daten immens im Vergleich zur Immunfluoreszenz-Mikroskopie mit Vergrößerungslinse bis zu 60x, Vergleich der Beobachtungen durch die Abbildung erhalten Durchflusszytometer mit klassischen, Z-Stapel,und konfokale Mikroskopie Bilder ist wertvoll, um eine bessere Detail zu erhalten, da die Objektivlinse in einem Mikroskop Vergrößerung liefern bis 100x und Z-Stapel-Bilder geben eine 3-dimensionale Eindruck von den Strukturen, die in derselben nicht erreichbar ist, durch Abbilden Durchflusszytometer Zelle. Die relative hohe Anzahl von ähnlichen Zellen in einem multispektralen Abbildungs Durchflusszytometrie Experiment gesammelt, bei einer zufälligen Orientierung, teilweise kompensiert diese Einschränkung ermöglicht Beobachtungen aus einem anderen Gesichtspunkt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Forschungs Durchflusszytometrie Kern am Cincinnati Children Hospital Research Foundation und Richard Demarco, Sherree Freund und Scott Mordecai aus der Amnis Corporation (Teil der EMD Milllipore) für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt K08HL088126 und R01HL116352 (TAK) und P30 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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