Summary
Este sistema modelo se inicia a partir de un gel de fibrina-miofibroblastos poblado que se puede utilizar para estudiar colágeno endógeno (re) organización en tiempo real de una manera no destructiva. El modelo de sistema es muy sintonizable, ya que se puede utilizar con diferentes fuentes de células, aditivos de medio, y se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas.
Abstract
Contenido de colágeno y la organización en el desarrollo de tejidos de colágeno pueden ser influenciados por las cepas locales del tejido y tejido de restricción. Ingenieros de tejidos pretenden utilizar estos principios para crear tejidos con colágeno arquitecturas predefinidas. Una comprensión completa de los procesos subyacentes exactas de la remodelación del colágeno para controlar la arquitectura final del tejido, sin embargo, es insuficiente. En particular, se sabe poco acerca de la orientación de la (re) producción de fibras de colágeno en respuesta a cambios en las condiciones de carga mecánica del tejido. Hemos desarrollado un sistema modelo in vitro, que consiste en biaxialmente con limitaciones de miofibroblastos cabezas de serie de fibrina construcciones, para aclarar aún más colágeno (re) orientación en respuesta a i) revertir biaxial a condiciones de carga estática uniaxiales y ii) cíclico carga uniaxial de la biaxialmente limitado construcciones antes y después de un cambio en la dirección de carga, con el uso del dispositivo de carga FX4000T Flexcell. Time-lapse confocal de imágenes se utiliza a visualize orientación colágeno (re) de una manera no destructiva.
Células y colágeno organización en las construcciones se puede visualizar en tiempo real, y un sistema de referencia interna nos permite reubicar las células y las estructuras de colágeno para un análisis cronológico. Varios aspectos del sistema de modelo se pueden ajustar, como fuente de células o el uso de células sanas y enfermas. Los aditivos pueden ser utilizados para aclarar aún más los mecanismos de remodelación del colágeno subyacente, por ejemplo la adición de las MMPs o el bloqueo de las integrinas. Forma y tamaño de la construcción se pueden adaptar fácilmente a las necesidades específicas, lo que resulta en un sistema modelo altamente ajustable para estudiar la organización de células y colágeno (re).
Introduction
Tejidos cardiovasculares tienen una función de soporte importante. En particular, el contenido y la organización de las fibras de colágeno en la matriz extracelular contribuir a las propiedades de carga y dominar a la fuerza general del tejido 1. En la ingeniería de tejidos se utiliza acondicionado mecánico de la construcción - por lo general consiste en (cíclico) regímenes tensos - para mejorar la organización del tejido y las propiedades mecánicas 2,3. Aún no se ha logrado la comprensión completa de la organización de colágeno inducida por deformación en geometrías complejas de tejidos para crear tejidos con colágeno arquitectura predefinida. Esto se debe principalmente a nuestro conocimiento limitado de la remodelación del colágeno en los tejidos en desarrollo. Los modelos existentes dan principalmente información sobre el resultado neto final de la remodelación del colágeno con el uso de la tensión estática 4-6. Aquí, se proporciona un sistema modelo altamente ajustable que permite el estudio de la organización de colágeno (re) de una manera en tiempo real, en 3D, bajo la influenciade tensión estática o cíclico. Las construcciones son de tejido a base de fibrina, asegurarse de que todas las colágeno en la construcción es endógeno. Células y colágeno organización en las construcciones se visualiza, y un sistema de referencia interna nos permite reubicar las células y las estructuras de colágeno para un análisis cronológico. En este protocolo se describe el uso del sistema de modelo para células Vena safena Humanos (HVSCs), ya que estas células son conocidos por su aumento de la producción de matriz extracelular y la capacidad de remodelar la matriz y el uso establecido en los tejidos cardiovasculares de ingeniería 7, basado en la obra de De Jonge et al. 8
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Protocol
1. Cultura de la vena safena Humanos Células
- Aislar las células de la vena safena magna, adquirido a partir de un donante, de conformidad con las directrices para el material de uso secundario, de acuerdo con el protocolo por Schnell et al. 9 y almacenar estos en nitrógeno líquido. Desde la parte de la vena safena magna de uno piezas cortadas donantes de 2 x 2 mm a la cultura en una placa de seis pocillos. Utilice 2 piezas por pocillo. Suficientes células pueden obtenerse generalmente para llenar cerca de 3 viales de 0.25 x 10 6 células en nitrógeno líquido. HVSCs se caracterizan como miofibroblastos, por que muestra la expresión de vimentina, ninguna expresión de desmina y una subpoblación expresar α actina del músculo liso 10. Siguiente iniciar el protocolo de descongelar las células del nitrógeno líquido para aumentar el número de células.
- Colocar las células de un vial en un matraz de cultivo de tejido T75 y añadir medio de crecimiento (GM), que consta de avanzada DMEM, 50 ml de suero de bovino fetal (FBS), 5 ml de penicilina /estreptomicina y 5 ml de L-glutamax. Cambie medio cada 2-3 días.
- Las células crecen confluente aproximadamente después de 14 días. Tienda 0.5 x 10 6 células en un vial en nitrógeno líquido, denominado paso 1.
Nota: La congelación de las células no es necesario cuando la cosecha HVSCs, pero se utiliza únicamente para el almacenamiento.
- Coloque los HVSCs de un vial en un frasco de cultivo de tejidos T175 y añadir GM. Cambie medio cada 2-3 días. Las células crecen confluente después de aproximadamente 7 días. Tienda 3 x 10 6 células en un vial en nitrógeno líquido, denominado paso 2.
- Coloque las células de un vial en una rollerbottle y añade GM. Cambie medio cada 2-3 días. Las células crecen confluente aproximadamente después de 8 días. Una rollerbottle contiene aproximadamente 20 a 30 x 10 6 células. Cultura células hasta el paso 6. No utilice las células de un pasaje más altos que el paso 9, ya que el fenotipo de células puede cambiar. 2. Ingeniería de construcciones de tejido a base de fibrina
- Preparar pegamento de silicona mezclando el elastómero con el agente de curado (10:01). Cortar 7 x 3 segmentos rectangulares mm de Velcro. Pegue el velcro en una placa de cultivo de 6 pocillos, con membranas flexibles para formar una cruz, y dejar un espacio cuadrado de 3 mm entre las tiras de velcro.
- Se seca el pegamento de silicona durante la noche en un horno a 60 ° C para asegurar el endurecimiento del pegamento. Esterilizar mediante la adición de EtOH al 70% a los pocillos y se incuba durante 30 min. Lavar 3 veces con PBS y PBS de eliminar todo el WELls y el velcro. Poner bajo UV durante 30 min y mantener estéril hasta su uso.
- Para preparar el medio de Ingeniería de Tejidos (TM), que consiste en GM y 130 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato.
- Añadir 1 mg / ml de ácido caproico ε-amino (ACA) de la TM. ACA se usa durante los primeros 7 días de cultivo para evitar que la fibrina se degrade 11. Alternativamente, se puede utilizar aprotinina.
- Para evitar la formación de grupo, permite fibrinógeno alcance la temperatura ambiente antes de abrirlo. Sin grumos fibrinógeno se disolverá más fácilmente. Disolver el fibrinógeno en una concentración de 10 mg real de proteína / ml TM 7 suplementado con ACA. La solución de fibrinógeno, podría ser necesaria filtro estéril varios filtros. Almacenar en hielo hasta su uso.
- Disolver la trombina a una concentración de 10 UI / ml TM 7 suplementado con ACA. Almacenar en hielo hasta su uso. </ Ol>
- Tripsinizar las células, resuspender en GM y el recuento.
- Usa 15 x 10 6 células / ml para la siembra de las construcciones de tejido a base de fibrina (concentración basada en métodos para válvulas cardíacas de ingeniería de tejidos 7). Un único gel consiste en 100 l gof el, y por lo tanto de 1,5 x 10 6 células. Ponga 10 6 células de 1,5 x en un tubo de centrífuga, lo que resulta en el mayor número tubos de centrífuga como el número de geles que se harán.
- Centrifugar las células a 350 xg durante 7 minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 50 l de trombina. Añadir 4 l de microesferas de poliestireno azul fluorescente a esta suspensión. Ponga 50 l de fibrinógeno en un vial. Utilice una pipeta para tomar la 50 l de trombina con las células. Aumentar el volumen de la pipeta a 100 l. Pipetear 50 l de la solución de trombina conlas células en el vial con fibrinógeno para mezclar la trombina y el fibrinógeno, y ocupan la mezcla de 100 l.
- Pipetear la mezcla de gel en y entre las tiras de Velcro. El tiempo de gelificación típico de los geles de fibrina, una vez que los componentes se mezclan, es del orden de 20 seg.
- Incubar suspensiones para 30 min a 37 ° C en un humidificado 95% de aire / 5% de CO 2 incubadora para permitir la gelificación antes de añadir la cultura TM con ACA.
- Reemplace TM con ACA cada 2-3 días para los primeros 7 días. Los geles son lo suficientemente estable después de una semana para ser cultivado sin ACA. Después de la primera semana reemplazar TM cada 2-3 días. Añadir 6 ml de TM por pocillo. El día 12 células han producido suficiente colágeno para la visualización.
- Cepa estático se aplica directamente por las células, debido a la tracción celular y compactación 12. Para inducir la reorganización de colágeno, cortar el tejido construir suelta de dos tiras de Velcro en una dirección. Esto se traduce en limitaciones unidireccionales (Figura 1A). Realice esto en 12 días, ya que el constructo es entonces lo suficientemente estable y el colágeno se ha depositado.
- Aplicar tensión cíclica mediante la aplicación de un vacío a la parte inferior de las placas de cultivo con membranas flexibles, con el uso del sistema de FX4000T Flexcell. Coloque las placas en una placa de base, en la parte superior de los puestos de carga (que son una parte de thdispositivo de carga cíclica e). La bomba se aplica un vacío sobre la membrana y por lo tanto tira de la membrana sobre el poste rectangular, se extiende por debajo. Debido a los archivos adjuntos en forma de cruz del tejido construye a la membrana (a través de la velcro) y el poste rectangular de la cepa cíclico aplicado es uniaxial (Figura 1B).
- Inicialmente, utilizar cultivo estático durante 5 días para lograr la integridad mecánica inicial, antes de la aplicación de la cepa cíclico a partir del día 6. Programa de un protocolo de tinción cíclico en el controlador para la bomba de vacío. Por ejemplo, usar un protocolo de tensión cíclica intermitente previamente establecido, con la dirección uniaxial 13. Este consiste en una cepa de intermitente de una onda sinusoidal con 1 Hz, el esfuerzo de 0 a 5% de deformación, por períodos de 3 hr, 3 hr alternadas con periodos de descanso. Lleve a cabo este protocolo de tensión cíclica durante 7 días, la inducción de una organización de colágeno alineadas.
- Normalmente, después de 12 días HVSCs han producido un organizatio colágeno alineadasn. Después de que se alcanza una organización de colágeno alineados, cambiar la dirección de la tensión cíclica uniaxial, para ser perpendicular a la dirección cepa original. Para ello, girar los postes rectangulares de 90 °.
- Para visualizar activo, la remodelación del colágeno en tiempo real, muestras de etiquetas con sondas que no interfieren con la viabilidad celular o la formación de colágeno. Usar sondas para teñir el citoplasma de la célula fluorescente y el colágeno.
- Alternativamente segunda generación de armónicos usando microscopía confocal de barrido láser se puede utilizar para visualizar las estructuras de colágeno utilizando autofluorescencia 14, con excitación a 780 nm y la detección entre 500-550 nm.
- Eliminar las placas de cultivo de la configuración y la incubadora, para las muestras en función del ciclo tensas durante el período de descanso de 3 horas, y transportarlos a un microscopio de escaneo láser confocal para visualizar las células y el colágeno.
Notas: Utilice sólo el lado suave del velcro y se enfrentan a este lado hacia arriba. Al pegar el velcro, sólo cubren el velcro con pegamento de silicona, no se extendió en todo el pegamento también. Dado que las placas de cultivo tienen fondos de membrana de silicona, usar algo por debajo de la placa de refuerzo para las membranas flexibles, para garantizar un fácil pegado en la placa.
Nota: Para disolver la mezcla de fibrinógeno suavemente para evitar la formación de espuma demasiado.
Nota: se necesita almacenamiento en hielo para evitar la gelificación inicial de trombina y fibrinógeno.
Nota: El fluorescente microesferas de poliestireno se utilizan como marcadores de referencia internos para el análisis de imagen. Cuando la mezcla de trombina y fibrinógeno, previenen la formación de burbujas de aire por pipeteo cuidadosamente la mezcla. Las burbujas de aire se traducirá en agujeros en el gel de fibrina.
Notas: Para ello, tan pronto como sea posible para evitar la gelificación antes de que la mezcla se pipeteó en la placa de pocillos. Practique antes de utilizar las células y los granos.
3. La aplicación de la tensión y la inducción de cambios en la cepa y limitaciones
4. Visualización de las células y el colágeno
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Representative Results
Este sistema modelo permite para el cultivo de miofibroblastos de semilla geles de fibrina. Figura 1A muestra un tejido cultivado primera virtud de las limitaciones biaxial estáticas. Limitaciones de tejido son liberados por corte del gel de fibrina a partir de dos restricciones, para crear restricciones estáticos uniaxiales, y compacta de tejido y remodela después (Figura 1A). Para cepa cíclico, el tejido se cultiva bajo limitaciones biaxial estáticas así. Después de 5 días tensión uniaxial cíclica puede ser aplicado (Figura 1B). Para inducir la reorientación colágeno, cepa dirección uniaxial se puede cambiar a la dirección perpendicular (Figura 1B). Las microesferas se sembró con la mezcla de gel, muestra un patrón aleatorio, que se utiliza para trasladar ubicaciones predefinidas para la proyección de imagen de lapso de tiempo (Figura 2). Figuras 2A y 2C muestran una imagen de las células, colágeno y perlas. Estas mismas imágenes se escanean 3 días (Figure 2B) y 2 días (Figura 2D) más tarde, respectivamente. Las células y los patrones de colágeno han cambiado, pero los patrones del grano se utiliza para trasladar las células y el colágeno. Muestras de cultivar durante 12 días resulta en la producción de colágeno endógeno en cantidades suficientes para ser visualizadas con microscopía confocal (figuras 3 y 4). Uso de cualquiera de los resultados del cultivo estáticas o cíclicas en claramente diferente organización de colágeno, donde la cultura estática biaxial da lugar a una organización de colágeno al azar (Figura 3A) y la tensión cíclica uniaxial aplicado a un biaxialmente limitados los resultados de tejido en una estructura de colágeno alineado (Figuras 4A y B) . Esta organización de colágeno puede ser estudiado con el tiempo, mientras que el cambio de las limitaciones estáticas o cambiar la dirección cepa cíclico. Cuando las restricciones estáticas se cambian de biaxial a uniaxial, los cambios de orientación de colágeno a partir de una orientación aleatoria (Figura 3A) A una orientación alineada (Figura 3B). Cepa cíclico induce un cambio de orientación en la superficie del tejido (Figuras 4A y C), pero después de 3 días, no se observa ningún cambio en el núcleo del tejido (Figuras 4B y D).
Figura 1. Construcciones cultivadas bajo restricciones biaxiales, utilizados para reorganizar colágeno por (A) la liberación de restricciones estáticas en una dirección, o (B) cambiar de dirección deformación cíclica. Cargando mensajes se indican con líneas negras punteadas. Las barras de escala indican 3 mm.
Figura 2. Un ejemplo típico del uso de patrones del grano de trasladar ubicaciones predefinidas en 3D, en este caso en forma estáticamuestras de cultivo. Las células se muestran en rojo, el colágeno en verde y granos en azul. A y C muestran una imagen de las células, el colágeno y los granos. Estas imágenes se escanean 3 días (B) y 2 días (D) más tarde, respectivamente. Patrones del grano se utilizan para trasladar las células y el colágeno. La barra de escala indica 50 micras.
Figura 3. R imágenes epresentante de 12 días la tensión estática con limitaciones biaxiales (A) y la reorientación debido a las limitaciones uniaxiales plazo de 7 días (B) bar. Escala indica 50 micras.
La Figura 4. Imágenes representativas después de 12 días (5 días estáticas, seguido por la tensión cíclica de 7 días) para la tensión cíclica en la superficie (A) Y ~ 60 micras en el tejido (B). Después de un cambio en la dirección cepa cíclico (después de 12 días), en las células de la superficie de colágeno y reorientar (C), pero no se observan cambios en el núcleo del tejido (D) después de 3 días.
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Discussion
El sistema modelo descrito de construcciones de fibrina por células pobladas tiene un gran potencial para el estudio de células y colágeno (re) organización (de Jonge et al. 15), por ejemplo, para ser utilizado para los propósitos de ingeniería de tejidos. Mediante el uso de fibrina como el portador inicial de la célula, después de la degradación de fibrina, se crea un tejido con las células y la matriz sólo endógena. De esta manera, las células son estimuladas para reaccionar a la cepa, ya sea estático o cíclico en la naturaleza, mediante la aplicación de fuerzas contráctiles 16,17, límite de detección de la rigidez 12, o mostrar la evitación cepa.
Significado: constructos de fibrina se han usado antes para estudiar colágeno (re) organización 18, pero no con la capacidad de aplicar tensión cíclica y / o el estudio de las construcciones de una manera de lapso de tiempo, ambos de los cuales son posibles en este método presentado. Las tiras de velcro que proporcionan las limitaciones de este modelo de sistema se han utilizado antes del 19,pero la combinación de esta técnica con placas de cultivo con membranas flexibles permite aplicar la tensión cíclica de períodos prolongados de tiempo. El cultivo en estas placas permite la fácil adición y eliminación del medio y la visualización de las construcciones mientras que todavía adjunto y estéril. Esto permite el estudio de los procesos de remodelación pertinentes tiempo-caducado o incluso en tiempo real.
Modificaciones y futuras aplicaciones: aplicaciones futuras del sistema se pueden encontrar en la manipulación del proceso de remodelación en 3D, por ejemplo, mediante la adición de metaloproteinasas o agentes que interfieren con el montaje o la integrina señalización. Junto a la aplicación de aditivos, los componentes del sistema de modelo pueden ser fácilmente modificados en el estudio de la organización de células y colágeno (re). Las diferentes fuentes de células, las células sanas y enfermas, la madurez de la matriz de colágeno (por ejemplo, mediante la variación de tiempo de cultivo), y la forma y el tamaño de la construcción se pueden adaptar a las necesidades específicas. El sistema es así suited para otras fuentes de células, en lugar de los HVSCs utilizados actualmente. Ya hemos usado este sistema de cultivo de células endoteliales que forman colonias (ECFCs; PlosOne, aceptado para su publicación), donde se observa que ECFCs orientar su colágeno producido de manera diferente a la tensión cíclica de HVSCs.
Limitaciones de la técnica: Una limitación del sistema de modelo actual es el tamaño relativamente grande de los tejidos, lo que requiere 1,5 x 10 6 células por construcción cuando se utiliza una densidad celular de 15 x 10 6 células / ml. Esto puede suponer un problema en los casos en que se utilizan fuentes de células menos disponibles. Otra limitación es el espesor actual de los constructos (aproximadamente 1 mm), lo cual es debido a los (espesor) Cierres de velcro. Esto limita el confocal de barrido para sólo una parte de toda la muestra. Es posible llegar a una profundidad de máximo 200 micras en el tejido, lo cual es suficiente para visualizar las respuestas celulares dentro del núcleo de los tejidos actuales, pero haceres no dar lugar a una visión de espesor total.
Los pasos críticos y resolución de problemas: A medida que el sistema de modelo se basa en la formación de tejido entre los puntos de fijación de Velcro, esto también abarca los pasos críticos en el protocolo. Corte correcto y pegar es esencial y especial se debe prestar atención a la pipeta cuidadosamente la mezcla de gel en las tiras de velcro para una fijación adecuada del tejido, que es crucial para la aplicación de la tensión cíclica. Otros pasos determinantes se pueden encontrar en la elección de la fuente de células y aditivos medio. Será necesaria la optimización cuando se cultiva con una fuente de células diferentes. Actualmente, las construcciones se cultivaron con ACA durante 7 días, para detener la fibrina a partir de degradantes. Una fuente de células diferente también puede resultar en un marco de tiempo diferente con respecto tanto a la formación de colágeno y la degradación de la fibrina.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio se realizó en el programa de investigación de los materiales biomédicos (BMM) instituto. BMM está cofinanciado por el Ministerio de Asuntos Económicos, Agricultura e Innovación holandés. La contribución financiera de la Hartstichting Nederlandse se agradece.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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