Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale
Summary
Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.
Abstract
Imagerie time-lapse est une technique qui permet l'observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l'analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L'imagerie confocale d'un embryon de poisson zèbre direct requiert qu'un tissu d'intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d'un colorant injecté. Le processus exige que l'embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l'imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d'effectuer à long terme dans l'imagerie in vivo d'embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l'anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n'importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.
Introduction
Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux 1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d'embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect continu à des cellules et des tissus d'un embryon en développement. Chaque image dans une série time-lapse prête contexte aux autres, et permet un mouvement d'enquêteur vers déduire pourquoi un phénomène se produit plutôt que de déduire ce qui se passe à ce moment-là.
L'imagerie in vivo est donc un outil descriptif puissant pour des approches expérimentales dedéconstruire les voies qui guident la morphogenèse. Le Danio rerio est un modèle génétique populaire du développement embryonnaire des vertébrés, et est particulièrement bien adapté pour l'imagerie in vivo de la morphogenèse. Moderne, des méthodes pratiques pour la transgenèse et la modification génomique sont progressent rapidement le nombre d'outils disponibles pour les chercheurs de poisson zèbre. Ces outils améliorent les méthodes déjà robustes pour la manipulation génétique et la microscopie. L'imagerie in vivo de presque n'importe quel tissu dans presque n'importe quel contexte génétique désiré est plus proche de la réalité que l'imagination.
Mouvements morphogénétiques des arcs branchiaux sont guidés par les interactions entre la crête neurale et l'épithélium adjacent, à la fois l'ectoderme et l'endoderme de signalisation. Il existe de nombreuses molécules de signalisation exprimés par l'épithélium qui sont nécessaires pour conduire la morphogenèse des éléments du squelette cranio-faciales. Parmi ces molécules de signalisation, Sonic Hedgehog (Shh) est d'une importance cruciale fou développement cranio-facial 2-8. Shh est exprimé à la fois par l'ectoderme bouche et du pharynx endoderme 2,6,9,10. L'expression de Shh dans l'endoderme régule les mouvements morphogénétiques des arceaux 10, la structuration de la crête neurale dans les arches 10, et la croissance du squelette cranio-facial 11.
Signalisation BMP est également d'une importance cruciale pour le développement cranio-facial 12 et peut modifier la morphogenèse des arcs branchiaux. Signalisation de la Bmp régule dorsale / ventrale structuration de crête dans les arcs branchiaux 13,14. Perturbation des Smad5 chez le poisson zèbre provoque des malformations graves palatines et un échec des cartilages de Meckel à fusionner de manière appropriée à la ligne médiane 15. En outre, les mutants présentent également des réductions et de la fusion des éléments du cartilage ventrale, avec le 2 ème, 3 ème et 4 ème éléments parfois pharyngée arc soudés à la ligne médiane 15. Ces fusions suggèrent fortement que la signalisation BMP dirige la morphogenèse de ces éléments du pharynx.
Signalisation PDGF est nécessaire pour le développement cranio-facial, mais a des rôles inconnus en arc branchial morphogenèse. La souris et le poisson zèbre ont mutants PDGFRA profonde clefting midfacial 16-18. Au moins chez le poisson zèbre ce clefting midfacial est due à un échec de la migration des cellules de la crête neurale bon 16. Cellules de la crête neurale continuent d'exprimer PDGFRA après qu'ils ont pénétré dans les arcs branchiaux. En outre, les ligands de PDGF sont exprimés par l'épithélium du visage et dans les arcs branchiaux 16,19,20, ainsi signalisation Pdgf pourraient également jouer un rôle dans la morphogenèse des arcs pharyngiens après la migration. Toutefois, les analyses de la morphogenèse des arcs pharyngiens dans des mutants de PDGFRA n'ont pas été effectuées.
Ici, nous démontrons dans la microscopie confocale in vivo de pharyngulune étape de poisson zèbre transgénique et décrire la morphogenèse des arcs pharyngiens dans ce délai. Nous démontrons en outre les comportements de tissus qui sont touchés par des mutations qui perturbent le BMP, le PDGF, et les voies de signalisation de Shh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l'analyse du développement. Ici, nous démontrons l'utilité de la méthode dans l'étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l'échelle cellulaire 28. De nom…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Melissa Griffin et Jenna Rozacky pour leurs soins de poissons d'experts. PDM grâce EGN pour aide à la rédaction, la générosité et la patience. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR R01DE020884 à JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Riferimenti
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