4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi
Summary
Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.
Abstract
Zaman atlamalı görüntüleme morfolojilerinden işleminin doğrudan gözlemlenmesine olanak sağlayan bir teknik veya şeklin kuşaktır. Nedeniyle optik netlik ve genetik manipülasyon amenability için, Zebra balığı embriyosu yaşayan embriyoların morfolojilerinden zaman atlamalı analizi gerçekleştirmek için hangi ile popüler bir model organizma olmuştur. Canlı bir Zebrafish embriyo Konfokal görüntüleme ilgi konusu bir doku sürekli bir transgenin ya da enjekte boya gibi, bir flüoresan işaretleyici ile etiketlenir gerektirir. Bu süreç embriyo anestezi uygulandı ve sağlıklı gelişim normal olarak devam eder ki bu şekilde yerinde tutulur talep etmektedir. Görüntüleme için Parametreler üç boyutlu büyüme için hesap ve geliştirme enstantaneler elde ederken, bireysel hücrelerin çözme talepleri dengelemek için ayarlanmış olması gerekir. Bizim sonuçlar floresan etiketli Zebra balığı embriyolarının in vivo görüntüleme uzun vadeli gerçekleştirmek ve çeşitli doku davranışlarını tespit etmek için yeteneğini göstermekkraniofasyal anormallikleri neden kranial nöral krest. Anestezi ve montaj kaynaklanan gelişimsel gecikmeler minimal ve embriyolar bu süreçte zarar görmez. Zaman atlamalı görüntüsü embriyo gelişiminde daha sonra noktalarında sıvı ortam döndü ve daha sonra görüntülü ya da sabitlenebilir. Transgenik zebrafish hatları ve iyi karakterize kaderi haritalama ve transplantasyon teknikleri, görüntüleme artan bir bolluk ile istenilen doku mümkündür. Gibi, in vivo görüntüleme time-lapse mutant ve mikroenjeksiyon embriyo analizleri dahil olmak üzere Zebra balığı genetik yöntemleri ile güçlü birleştirir.
Introduction
Kraniyofasiyal morfonogenezi birden fazla hücre tipleri arasında koordineli etkileşimi gerektiren karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir. Kraniofasiyal iskeletin çoğunluğu nöral krest hücrelerinden türetilen, birçoğu yutak kemerleri 1 adlandırılan geçici yapılar içine dorsal nöral tüp geçirmek gerekir. Birçok dokuda olduğu gibi, kraniofasiyal iskeletin morfonogenezi spesifik gelişimsel zaman noktalarında embriyoların statik görüntüleri anlaşılabilir daha karmaşıktır. Zaman alıcı gerçekleştirmek olmasına rağmen, in vivo time-lapse mikroskopi gelişmekte olan bir embriyonun hücre ve dokularda sürekli bir görünüm sağlar. Bir time-lapse serisinde her görüntü diğerlerine bağlamı ödünç, ve bir fenomen oluşur neden çözmekten ziyade o anda neler olduğunu çözmekten doğru bir araştırmacı hareket olur.
Vivo görüntüleme böylece deneysel yaklaşımlar için güçlü bir açıklayıcı araçtırmorfogenetiğine kılavuz yollar yapısızlaştırmak. Zebra balığı Br.rerio omurgalı embriyonik gelişim popüler bir genetik modelidir, ve özellikle de morfojenezinin in vivo görüntüleme için uygundur. Modern, transgenesis ve genomik değişiklik için uygun yöntemler hızla Zebrafish araştırmacılar için mevcut araçların sayısını ilerlemektedir. Bu araçlar, genetik manipülasyon ve mikroskopi için önceden güçlü bir yöntem geliştirir. Hemen hemen arzu edilen herhangi bir genetik bağlamda hemen hemen herhangi bir doku içinde vivo görüntüleme fantezi daha gerçeğe yakın.
Faringeal kemerlerin morfogenetik hareketleri nöral ve komşu epitel, ektoderm hem endoderm arasındaki etkileşimleri sinyal tarafından yönlendirilir. Kraniofasiyal iskelet elemanları morfojenezini sürmek için gerekli olan epitel tarafından ifade edilen çok sayıda sinyal molekülleri vardır. Bu sinyal molekülleri arasında, Sonic Hedgehog (Sus) önem fveya Kraniyofasiyal kalkınma 2-8. Shh'si oral ektodermden ve farenks endoderm 2,6,9,10 ikisi tarafından ifade edilir. Endoderm Shh ekspresyonu kemerler 10, 10 kemerlerin içinde nöral krestin modelleme ve kraniofasiyal iskeletin 11 büyüme morfojenik hareketlerini düzenler.
Bmp sinyali de kraniofasiyal gelişimi 12 için kritik önem taşımaktadır ve yutak kemerlerin morfogenetiğine değiştirebilir. Bmp sinyalizasyon yutak kemerlerin 13,14 içinde kret dorsal / ventral desenlendirme düzenler. Zebrafish smad5 bozulması şiddetli damak kusurları ve orta hatta 15 de uygun sigorta Meckel kıkırdaklarının bir hata neden olur. Buna ek olarak, mutantlan 2., 3., ve orta hattı 15 da kaynaşık bazen 4. yutak kemer elemanları ile ventral kıkırdak elemanları azalma ve füzyon, ekran. Bu füzyonları BMP güçlü bir sinyal, bu yutak elemanların morfojenezini yönlendirir olduğunu göstermektedir.
PDGF sinyalizasyon Kraniyofasiyal gelişimi için gerekli olan, ancak faringeal kemer morfogenezindeki bilinmeyen rolleri vardır. Fare ve zebra balığı PDGFRA mutantlar Hem derin midfasiyal yarıklaşmanın 16-18 var. En azından Zebrafish bu midfasiyal Clefting uygun nöral krest hücrelerinin göç 16 bir başarısızlık nedeniyle. Nöral krest hücreleri yutak kemerler girdikten sonra PDGFRA ifade ediyor. Ayrıca, PDGF ligandlar yüz epitellerinden ifade edilir ve yutak kemerler 16,19,20 içinde, böylece PDGF sinyal de göç aşağıdaki yutak kemerli morfolojilerinden bir rol oynayabilir. Ancak, PDGFRA mutantlar faringeal kemerler yapılmamıştır morfogenezindeki analizleri.
Burada, biz pharyngul konfokal mikroskopi göstermekBir aşamalı transgenik zebra balığı ve bu süre içinde yutak kemerlerin morfogenetiğine açıklar. Biz daha BMP, PDGF ve Shh'si sinyalizasyon yolları bozmaya mutasyonların etkilenen doku davranışlar göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse konfokal mikroskopi gelişim analizi için güçlü bir araçtır. Burada, biz nöral krest hücreleri etiketler bir transgenik kullanarak önemli bir sinyal yollar için mutant olan zebrabalıkları faringeal kemer morfogenetiğine okuyan metotun göstermektedir. Doku seviyesine ek olarak zaman atlamalı analizler de hücresel ölçekte 28 analizleri için geçerlidir, analiz eder. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir yöntem, aynı zamanda zebra balığı morpholinos mikroenjeksiyonu, mRNA ya …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların uzman balık bakımı için Melissa Griffin ve Jenna Rozacky teşekkür ederim. PDM teşekkürler EGN yardım, cömertlik, sabır ve yazma için. Bu çalışma JKE NIH / NIDCR R01DE020884 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Riferimenti
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
